TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2KHOA SINH – KTNN===o0o===
PHẠM THỊ NHUNG
HOÀN THIỆN QUY TRÌNHNHÂN GIỐNG LAN KIM TUYẾN(ANOECTOCHILUS SETACEUS BLUME)BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾBÀO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌCChuyên ngành: Sinh lý học thực vật
HÀ NỘI, 2016
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2KHOA SINH – KTNN===o0o===
PHẠM THỊ NHUNG
HOÀN THIỆN QUY TRÌNHNHÂN GIỐNG LAN KIM TUYẾN(ANOECTOCHILUS SETACEUS BLUME)BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾBÀOKHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌCChuyên ngành: Sinh lý học thực vật
Người hướng dẫn khoa học:TS. La Việt Hồng
HÀ NỘI, 2016
LỜI CẢM ƠNTrước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đếnTS. La Việt Hồng đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúpđỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.Tôi xin chân thành cảm ơn ban Lãnh đạo trường Đại học Sư phạm HàNội 2, Ban chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN trường học Sư phạm Hà Nội 2, đãtạo mọi điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành khóa luận này.Trong thời gian thực hiện đề tài tôi cũng nhận được sự giúp đỡ tậntình của cô Mai Thị Hồng – Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật đã giúp đỡ,đóng góp ý kiến để tôi hoàn thành khóa luận này, nhân đây tôi cũng xinchân thành cảm ơn.Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, tạo mọiđiều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi học tập cũng như hoàn thànhkhóa luận.Mặc dù đã hết sức cố gắng nhưng do điều kiện thời gian và trình độchuyên môn còn nhiều hạn chế nên không tránh khỏi những thiếu sót, tôirất mong nhận được sự góp ý của quý thầy cô để khóa luận của tôi có thểhoàn thiện hơn.Tôi xin chân thành cảm ơn!Hà Nội, ngày 12 tháng 04 năm 2016Sinh viên
Phạm Thị Nhung
LỜI CAM ĐOANTôi xin cam đoan kết quả nghiên cứu đề tài: “Hoàn thiện quy trìnhnhân giống lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) bằng kỹthuật nuôi cấy mô tế bào” là kết quả nghiên cứu của riêng tôi do TS. La ViệtHồng hướng dẫn. Các số liệu, kết quả trong nghiên cứu này là trung thực vàchưa được ai công bố.Hà Nội, ngày 12 tháng 04 năm 2016Sinh viên
Phạm Thị Nhung
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
NAA:
Napthlacetic acid
BAP:
6-Benzyl amino purin
KI:
Kinetin
MS:
Murashige và Skoog
Nxb:
Nhà xuất bản
CT:
Công thức
ĐC:
Đối chứng
TDZ:
Thidiazuron
MỤC LỤCMỞ ĐẦU ………………………………………………………………………………………….. 11. Lý do chọn đề tài …………………………………………………………………………. 12. Mục đích nghiên cứu ……………………………………………………………………. 33. Nội dung nghiên cứu ……………………………………………………………………. 34. Phạm vi nghiên cứu ……………………………………………………………………… 35. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn ……………………………………………. 3NỘI DUNG ……………………………………………………………………………………….. 4Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ……………………………………………………. 41.1. Giới thiệu về cây lan Kim tuyến………………………………………………….. 41.1.1. Phân loại ……………………………………………………………………………. 41.1.2. Đặc điểm thực vật học ………………………………………………………….. 41.1.3. Sinh học và sinh thái ……………………………………………………………. 51.1.4. Phân bố ………………………………………………………………………………. 51.1.5. Công dụng của lan Kim tuyến ……………………………………………….. 51.1.6. Thực trạng khai thác và phát triển cây lan Kim tuyếnở Việt Nam …………………………………………………………………………………… 81.1.7. Các loài lan Kim tuyến có ở Việt Nam ……………………………………. 81.2. Tình hình nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn lan Kim tuyến …….. 101.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ……………………………………….. 101.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ………………………………………….. 12Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……………….. 152.1. Vật liệu thực vật ……………………………………………………………………… 152.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ………………………………………………….. 152.2.1. Dụng cụ ……………………………………………………………………………. 152.2.2. Thiết bị ……………………………………………………………………………… 152.3. Môi trường nuôi cấy ………………………………………………………………… 15
2.4. Điều kiện nuôi cấy in vitro ……………………………………………………….. 152.5. Phương pháp nghiên cứu ………………………………………………………….. 162.5.1. Bố trí thí nghiệm ………………………………………………………………… 162.5.3. Phương pháp phân tích thống kê kết quả thực nghiệm ……………. 18Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN …………………….. 193.1. Hoàn thiện giai đoạn tái sinh lan Kim tuyến in vitro ……………………. 193.2. Hoàn thiện giai đoạn ra rễ tạo cây lan Kim tuyến in vitrohoàn chỉnh…………………………………………………………………………………….. 223.3. Hoàn thiện giai đoạn rèn luyện cây lan Kim tuyến với điều kiệntự nhiên ………………………………………………………………………………………… 24KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ……………………………………………………………. 26TÀI LIỆU THAM KHẢO ……………………………………………………………….. 27
DANH MỤC CÁC BẢNGBảng 2.1: Ảnh hưởng của BAP và Kinetin đến khả năng tạo cụm chồicây lan Kim tuyến ………………………………………………………………17Bảng 2.2: Ảnh hưởng của α – NAA đến tạo rễ của cây lan Kim tuyếnin vitro………………………………………………………………………………17Bảng 2.3: Ảnh hưởng của giá thể tới tỉ lệ sống của lan Kim tuyếnin vitro………………………………………………………………………………18Bảng 3.1. Kết quả tái sinh chồi lan Kim tuyến (số chồi/mẫu) ………………..19Bảng 3.2. Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh in vitro lan Kim tuyếnBảng 3.3. Rèn luyện cây in vitro ngoài tự nhiên
………………..23
………………………………24
DANH MỤC CÁC HÌNHHình 1.1. Lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume ………………………. 4Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu ………………………………………………………………… 16Hình 3.1. Cụm chồi lan Kim tuyến ……………………………………………………… 21Hình 3.2. Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh in vitro từ chồi lan Kim tuyến…………… 23Hình 3.3. Rèn luyện cây lan Kim tuyến ngoài môi trường tự nhiên ở cácgiá thể khác nhau ………………………………………………………………… 25
MỞ ĐẦU1. Lý do chọn đề tàiLan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) thuộc họ Phong lan(Orchidaceae) là loại thảo dược quý hiếm của Việt Nam [1]. Ở nước ta, câylan Kim tuyến mọc rải rác ở trong rừng núi đá vôi, nơi ẩm, dọc theo khesuối, ở độ cao 300-1000 m như Sa Pa (Lào Cai), Quản Bạ (Hà Giang), TamĐảo (Vĩnh Phúc), Mĩ Đức (Hà Tây)… Lan Kim tuyến được cấp báo thuộcnhóm IA của Nghị định 32/2006/CP, nghiêm cấm khai thác vì mục đíchthương mại [3] và nhóm thực vật rừng đang nguy cấp EN A1a, c, d, trongsách đỏ Việt Nam [4].Trong y học, lan Kim tuyến được sử dụng làm thuốc trị lao phổi, ho dophế nhiệt, phong thấp, đau nhức khớp xương, chấn thương, viêm dạ dàymãn tính, viêm khí quản, viêm gan mãn tính, suy nhược thần kinh, giúp tăngcường sức khoẻ, làm khí huyết lưu thông, có tính kháng khuẩn [24].Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng khắc phục được nhiều trởngại mà những phương pháp nhân giống khác thường gặp, sau đây là nhữngưu điểm chính: cây con được trẻ hóa và sạch bệnh, vì vậy có tiềm năng sinhtrưởng, phát triển và đạt năng suất cao. Tạo cây con đồng nhất về mặt ditruyền, bảo tồn được các tính trạng đã chọn lọc. Tạo được dòng thuần củacác cây tạp giao. Tạo được cây có gen mới (đa bội, đơn bội). Bảo quản vàlưu trữ tập đoàn gen. Có khả năng sản xuất quanh năm. Có thể nhân nhanhnhiều cây không kết hạt trong những điều kiện sinh thái nhất định hoặc hạtnảy mầm kém. Hệ số nhân giống cực cao, rút ngắn thời gian đưa một giốngmới vào sản xuất đại trà [2].Về phương diện hệ số nhân giống, nhân giống in vitro là phương phápkhông gì có thể so sánh kịp, kể cả phương pháp nhân giống bằng hạt. Theo
Phạm Thị Nhung
1
Mai Thị Tân và cộng sự đã đạt được hệ số nhân 532 trong vòng một năm đốivới cây khoai tây bằng phương pháp này [11].Quá trình nhân giống cây trồng trong môi trường in vitro gồm nhiềugiai đoạn khác nhau gồm: (i) tạo vật liệu khởi đầu; (ii) nhân nhanh chồi; (iii)ra rễ cho chồi in vitro và (iv) chuyển cây ra rèn luyện với điều kiện tự nhiên.Mỗi giai đoạn có những yêu cầu riêng. Trong đó giai đoạn quan trọng nhấtquyết định sự thành công của quy trình nuôi cấy là giai đoạn nhân nhanhchồi và giai đoạn rèn luyện cây con thích nghi với môi trường tự nhiên [21].Tại Việt Nam cũng đã có một số công bố về nhân giống và bảo tồn lanKim tuyến như: Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (2012) đã tìm ra môitrường nhân nhanh thích hợp nhất cho thể chồi và mắt đốt ngang thân làKnud* + 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin + 0,3 mg/l α-NAA + 20 g/lsucrose + 0,5 g/l than hoạt tính + 7 g agar/l đạt hệ số nhân chồi là 6,55chồi/mẫu [13]. Năm 2014, tác giả Trần Thị Hồng Thúy và cộng sự đã tìm ramôi trường Knudson C lỏng chứa 1% saccarozơ, 100 ml.L-1 nước dừa và0,5 mg.L-1 Kinetin, tỉ lệ hình thành PLBs đạt 86,25%, PLBs sinh trưởng tốt[14], tác giả Đỗ Mạnh Cường và cộng sự (2015) nghiên cứu ảnh hưởng củamột số yếu tố lên quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lan Gấm(Anoectochilus setaceus Blume) nuôi cấy in vitro [5]… Tuy nhiên, việcnghiên cứu này mới chỉ dừng lại ở một số giai đoạn mà chưa hoàn thiệnđược quy trình nhân giống cây lan này. Do vậy, tôi quyết định nghiên cứuđề tài: “Hoàn thiện quy trình nhân giống lan Kim tuyến (Anoectochilussetaceus Blume) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào” nhằm cải thiện mộtsố giai đoạn của quy trình nhân giống in vitro loài lan này với mục đích bảotồn và phát triển được nguồn giống lan Kim tuyến, cung cấp cây giống cóchất lượng cho thị trường.
Phạm Thị Nhung
2
2. Mục đích nghiên cứuHoàn thiện quy trình nhân nhanh loài lan Kim tuyến (Anoectochilussetaceus Blume) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào, nhằm góp phần bảotồn và phát triển loài lan dược liệu quý hiếm của Việt Nam, đáp ứng nhu cầucây lan Kim tuyến giống phục vụ nhu cầu con người.3. Nội dung nghiên cứuHoàn thiện giai đoạn nhân nhanh giống cây lan Kim tuyến bằng kỹthuật nuôi cấy mô tế bào thực vật.Hoàn thiện giai đoạn ra rễ của lan Kim tuyến in vitro.Hoàn thiện giai đoạn rèn luyện cây con lan Kim tuyến in vitro.4. Phạm vi nghiên cứuPhòng thí nghiệm Sinh lí thực vật, khoa Sinh – KTNN, trường Đại họcSư phạm Hà Nội 2.5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn5.1. Ý nghĩa khoa họcGóp phần bổ sung vào nguồn tài liệu nghiên cứu về nhân giống in vitrocây lan Kim tuyến.5.2. Ý nghĩa thực tiễnTạo ra được nguồn cây giống với số lượng lớn và sạch bệnh cung cấpcho thị trường.Góp phần bảo tồn được nguồn gen của loài lan Kim tuyến.
Phạm Thị Nhung
3
NỘI DUNGChương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về cây lan Kim tuyến1.1.1. Phân loạiGiới: Plantea (Thực vật)Bộ: AsparagalesHọ: OrchidaceaePhân họ: OrchidoideaeChi: AnoectochilusLoài: A. setaceusTên khoa học: Anoectochilussetaceus BlumeTên Việt Nam: Lan Kim tuyến
Hình 1.1. Lan Kim tuyếnAnoectochilus setaceus Blume
Tên gọi khác: Lan Gấm
[24]
1.1.2. Đặc điểm thực vật họcCây ưa độ ẩm cao và ưa bóng râm, kỵ ánh sáng, yêu cầu đất nhiềumùn, tơi xốp, thoáng khí. Cây bò trên mặt đất cao 10 – 20 cm, thân màutím, mọng nước, phần cây non có nhiều lông mềm, mang 2 – 6 lá mọccách, xòe trên mặt đất [24].Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, chóp hơi nhọn và có mũi ngắn, cỡ 3 – 4x 2 – 3 cm, có màu khác nhau với mạng gân thường nhạt hơn (màu lục sẫm
Phạm Thị Nhung
4
với mạng gân màu lục nhạt hay màu nâu – đỏ với mạng gân màu vàng – lụchay hồng); cuống lá dài 2 – 3 cm [3].Cụm hoa dài 10 – 15 cm, mang 4 – 10 hoa mọc thưa. Lá bắc hìnhtrứng, chóp thót nhọn, dài 8 – 10 mm, màu hồng. Hoa thường màu trắng, dài2,5 – 3 cm; các mảnh bao hoa dài khoảng 6 mm; môi dài đến 1,5 cm, ở mỗibên gốc mang 6 – 8 dải hẹp, chóp phiến rộng, chẻ hai sâu, hốc chứa mật dài7 mm, bầu dài 1,3 cm, màu lục, có nhiều lông mềm [3].1.1.3. Sinh học và sinh tháiMùa hoa tháng 2 – 4. Tái sinh bằng chồi từ thân rễ và hạt, ít và sinhtrưởng rất chậm. Mọc dưới tán rừng nguyên sinh, hầu hết là nguyên thủy,rậm thường xanh nhiệt đới mưa mùa cây lá rộng trên sườn núi đá granit,riôlit, phiến sét, ở độ cao 500 – 1600 m, rải rác thành từng nhóm vài ba câytrên đất ẩm, rất giàu mùn và lá cây rụng [3].1.1.4. Phân bốTrong nước: Lào Cai (Sapa: Phăng Xi Păng, Văn Bàn: Liêm Phú), HàTĩnh (Hương Sơn: Rào Àn), Quảng Trị, Kontum (Đắk Glei: núi Ngọc Linh,Sa Thầy: núi Chư Mom Ray), Đắk Lắk (Krông Bông: núi Chư Yang Sinh),Lâm Đồng (Lạc Dương: núi Bì Đúp) [3].Thế giới: Ấn Độ, Nêpan, Butan, Trung Quốc, Mianma, Thái Lan, Lào,Campuchia, Malaixia, Inđônêxia [3].1.1.5. Công dụng của lan Kim tuyếnTheo các tài liệu của Đài Loan thì lan Kim tuyến là một loại cây thuốcvô cùng quý giá, có bán tại các tiệm thuốc Bắc và được sử dụng phổ biếntrong nhân dân. Cây lan Kim tuyến có các tác dụng như: tăng cường sứckhỏe, làm khí huyết lưu thông; có tác dụng kháng khuẩn, chữa các bệnhviêm khí quản, viêm gan mãn tính; chữa thần kinh suy nhược, chữa ho khan,
Phạm Thị Nhung
5
đau họng, cao huyết áp, suy thận, chữa di tinh, đau lưng, phong thấp, làmtiêu đờm, giải độc, giải nhiệt… Và thường dùng cả cây tươi hoặc khô để sắcuống, liều thường dùng trong ngày là khoảng 20 g tươi hoặc 5 g khô [25].Ông Tả Mộc Thuấn – học giả người Nhật (năm 1924), nghiên cứu vềTrung y đã cho biết: Kim tuyến liên là một trong những cây thuốc quý trongdân gian; toàn thân cây thuốc được dùng để làm tăng cường sức khỏe, chủtrị bệnh phổi, di tinh, xuất tinh sớm, yếu gan, yếu tỳ và các vết thương dorắn cắn; còn có tác dụng bổ máu, giải nhiệt [25].Ông Sơn Điền Kim Trị (1932) cũng đã cho biết: Người dân tộc miềnnúi thường dùng Kim tuyến liên sắc uống để trị đau ruột, đau bụng, sốt cao,đắp bên ngoài để trị các chỗ sưng vết thương và chỗ bị rắn cắn [25].Trong sách Thanh thảo gia đình tự liệu pháp của ông Trần Đào Thíchcó viết: Trẻ em hay khóc dùng Kim tuyến liên sắc uống sẽ khỏi [25].Trong sách Khoa học quốc dược quyển I kỳ 2 (năm 1958) của ông TạA Mộc và Trần Kiến Đào đăng tải trong tạp chí Đài Loan dân gian dượcdụng thực vật, có nói đến Kim tuyến liên là một trong những dược thảo quýgiá, giúp bổ máu, dưỡng âm, chữa trị nóng phổi và nóng gan [25].Trong báo cáo điều tra năm 1964, ông Cam Vĩ Tùng đã cho biết: Kimtuyến liên là một vị thuốc hết sức quý giá trong các tiệm thuốc bắc ĐàiLoan, là cây thuốc mang tính mát và có vị ngọt, thanh nhiệt, thanh huyết, bổphổi, giải trừ u uất, thông trung khí, bồi dưỡng sức khỏe, chủ trị lục phủ ngũtạng đẩy lùi tâm hỏa, nóng gan, bệnh phổi, thổ huyết, ho hen, đau ngực, đaulá lách, đau cuống họng, cao huyết áp, trẻ con chậm lớn, suy thận [25].Trung y sư Thái Cát Hùng, Chủ tịch Hội đồng quản trị của Hội nghiêncứu cây thuốc thực vật thành phố Gia Nghĩa cho biết: Kim tuyến liên tiêuđờm, giải độc, hạ huyết áp, trợ tim, lợi tiểu, trị bệnh đái đường, chữa viêmgan, trị mụn và thường dùng cây tươi sắc uống [25].
Phạm Thị Nhung
6
Trong y học hiện đại bằng nhiều công trình nghiên cứu khoa học, cácnhà khoa học ở nhiều Viện và Trường đại học Y trên thế giới đã cung cấpcác bằng chứng cho thấy nhiều công dụng của lan Gấm – lan Kim tuyến như[26]:Điều trị ung thư: “Các chất chiết xuất từ thực vật Chi Lan Kim TuyếnA. formosanus và các thành phần có nguồn gốc từ nó được sử dụng như làcác loại thuốc thảo dược hoặc các chất bổ sung dinh dưỡng để ngăn ngừahóa chất (chemoprevention) hoặc điều trị bệnh lý ác tính của con người”.Nghiên cứu này đã được cấp bằng sáng chế ở Mỹ (US 7033617 B2).Tăng cường miễn dịch: Chi Lan Kim Tuyến có tiềm năng tăng cườnghệ miễn dịch. Các kết quả nghiên cứu cho thấy những tác dụng tăng cườnghệ miễn dịch rất quý của dịch chiết Chi Lan Kim Tuyến.Bảo vệ gan – Giải độc rượu: tác dụng bảo vệ gan, giải độc rượu củaChi Lan Kim Tuyến đã được chứng minh bằng nhiều công trình khoa học.Dung dịch nước chiết xuất của Chi Lan Kim Tuyến formosanus đã chothấy hoạt động bảo vệ gan đáng kể so với silymarin tiêu chuẩn. Các nghiêncứu độc tính cấp đã kết luận rằng nó có thể được coi là an toàn trong mộtthời gian dài.Điều trị tiểu đường: kinsenoside là một hợp chất hoạt tính sinh học cơbản có trong lan Gấm. Nó thể hiện các hiệu ứng dược lý như chống mỡmáu, chất chống oxy hóa, chống viêm, tăng cường miễn dịch, và các hoạtđộng bảo vệ gan và gần đây đã được phát triển như là một ứng cử viênthuốc trị đái tháo đường.Chống loãng xương: chiết xuất Chi Lan Kim Tuyến formosanus(arabinogalactan prebiotic) làm tăng hấp thu canxi và ngăn chặn sự tiêuxương.Bồi bổ cơ thể: rất nhiều khoáng chất hữu cơ và axit amin có trong lanKim tuyến giúp bồi bổ cơ thể phục hồi khí huyết.
Phạm Thị Nhung
7
1.1.6. Thực trạng khai thác và phát triển cây lan Kim tuyến ở Việt NamỞ Việt Nam, lan Kim tuyến có phân bố rộng nhưng với số lượng cá thểkhông nhiều, tái sinh chậm đòi hỏi điều kiện sống ngặt nghèo ngày cànghiếm.Theo khảo sát, nước ta có tới 15 loài lan Gấm phân bố rải rác ở rừngnhiều tỉnh, có thể tập hợp lại, trồng, xuất khẩu thu lợi nhuận. Tuy nhiên,cách khai thác loại dược liệu quý này mới chỉ là dạng nhỏ lẻ [27].Đặc biệt, cách đây vài năm, rộ lên cơn sốt lan Gấm khi các đầu mốiHàn Quốc, Đài Loan, Trung Quốc mua lại với giá khoảng 3,5 – 4 triệu đồng/1 kg tươi. Vì vậy, rất nhiều người dân đã lặn lội trong rừng sâu, lùng hái lálan Gấm để bán cho các đầu mối thu mua với giá khoảng 500 ngàn đồng1/kg lá tươi, dần dần khi khan hiếm, cạn kiệt, giá của lan Gấm được đẩy lên1,2 – 1,6 triệu đồng/1 kg lá tươi [27].Do bị thu hái nhiều để bán làm thuốc từ rất lâu, nên loài lan Kim tuyếnđang bị đe dọa nghiêm trọng, rất có thể sẽ bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên nếukhông có biện pháp bảo tồn hữu hiệu. Hiện nay, lan Kim tuyến được xếptrong nhóm IA của Nghị Định 32/2006/NĐ-CP, nghiêm cấm khai thác vìmục đích thương mại [3].Phải chăng, đã đến lúc chúng ta phải có những đánh giá nghiêm túc,công trình nghiên cứu chính thức về giá trị tài nguyên của dược liệu quý,chẳng hạn như cây lan Gấm… Để từ đó, có được những hướng phát triểncũng như khai thác các loại dược liệu quý, thay vì để các doanh nghiệp nướcngoài lợi dụng sự thiếu hiểu biết của ta để trục lợi.1.1.7. Các loài lan Kim tuyến có ở Việt NamTheo GS. Phạm Hoàng Hộ (Cây cỏ Việt Nam, tập III), ở Việt Nam chilan Kim tuyến gồm có những loài sau [6]:+ Loài Anoectochilus daoensis Gagnep. Còn gọi là Giải thùy tam đảo,phân bố ở Tam Đảo.
Phạm Thị Nhung
8
Phạm Thị Nhung
9
+ Loài Anoectochilus Chapaensis Gagnep; còn gọi là Giải thùy Sa Pa,được phát hiện năm 1931, chỉ có ở Việt Nam, tìm thấy tại Lào Cai (Sa Pa),Thừa Thiên – Huế (Bạch Mã); thế giới chưa biết.+ Loài Anoectochilus setaceus Blume (tên khác là Anoectochilusroxburghii (Wall.) Lindl.); còn gọi là Giải thùy tơ, Giải thùy Roxburgh,Kim tuyến đỏ, Sứa hồng; được phát hiện năm 1825, phân bố ở Lào Cai (SaPa, Phăng Xi Păng, Văn Bàn: Liêm Phú), Hà Tĩnh (Hương Sơn, Rào Ân),Quảng Trị, Kon Tum ( Đắk Glei, núi Ngọc Linh, Sa Thầy: núi Chư MormRay), Đắk Lắk (Krông Bông, núi Chư Yang Sinh), Lâm Đồng (Lạc Dương,núi Bì Đúp).+ Loài Anoectochilus Tridentatus Seidenf. Ex Aver; còn gọi là Giảithùy Ba Răng, được phát hiện năm 1990, chỉ có ở Việt Nam, mới tìm thấyở Vĩnh Phúc (Tam Đảo); thế giới chưa biết.1.2. Tình hình nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn lan Kim tuyến1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giớiTrong những năm gần đây, trên thế giới đã có nhiều cơ sở nghiên cứutìm các biện pháp nhân giống loài lan Kim tuyến quý hiếm có nguy cơ bịtuyệt chủng.Gangaprasad A và cộng sự (2000) nghiên cứu vi nhân giống hai loàilan A. sikkimensis và A. regalis. Hai loài lan Kim tuyến này được nuôi cấytrên môi trường Woody Plant Medium (WPM) sau 12 tuần tỷ lệ callus đượctạo ra 4,8 – 5,6 và số chồi tương ứng 95 – 98%. Khi mẫu được cấy chuyểnsang môi trường tương tự trên thì số chồi bên tăng 21,4 và chồi đỉnh là 8,2đối với loài A. regalis. Còn đối với loài A. sikkimensis sự bật chồi chậm hơn,số chồi bên đạt 12,3 và chồi đỉnh là 4,3 [17].Với công trình nghiên cứu gieo hạt in vitro cây A. roxburghii, tác giảHuang H và cộng sự (2002) đã tìm ra được môi trường Knudson C có bổsung 0,5 mg/L BAP + 20% dịch khoai tây là thích hợp nhất cho sự phát triểnprotocom từ hạt của A. roxburghii [18].
Phạm Thị Nhung
10
Vi nhân giống cây A. formossanus được tác giả Ket N.V và cộng sự(2004) nghiên cứu nhằm mục tiêu bảo tồn nguồn gen quý có nguy cơ bịtuyệt diệt. Đã tìm ra môi trường nhân nhanh cụm chồi thích hợp nhất là môitrường Hyponex có bổ sung 1 g dm-3 Benzyl adenin hoặc 1 – 2 mg dm-3Thidiazuron (TDZ). Bổ sung 1 g dm-3 than hoạt tính vào môi trường có chứaTDZ thúc phát triển chồi (11,1 chồi/mô cấy). Tuy nhiên, tốc độ chồi tái sinhchậm và không kéo dài thân. Trên môi trường Hyponex bổ sung 2% đườngvà 0,5 g dm-3 than hoạt tính thích hợp cho sự phát triển cụm chồi và tỷ lệ câyra rễ là 100% [19].Y.J. Shiau và cộng sự (2005) nghiên cứu nhân giống loài lan Kimtuyến (Haemaria discolor (Ker) Lindl. var.) bằng phương pháp gieo hạt invitro. Các hạt sau khi nảy mầm cấy chuyển trên môi trường ½ MS bổ sung0,2% than hoạt tính, 8% dịch chuối, 0,1 mg dm-3 (TDZ) và 1,0 mg dm-3(NAA) cho cây sinh trưởng và phát triển tốt. Có tới 96% cây sống sau khichuyển ra nhà kính [22].Zhou YuMei và cộng sự (2009) đã nghiên cứu xây dựng quy trìnhnhân nhanh giống cây A. formosanus. Kết quả cho thấy: Môi trường tối ưucho nhân nhanh chồi là môi trường MS có bổ sung 0,1 mg/l TDZ, 5% nướcdừa và 3% đường. Môi trường thích hợp cho rễ phát triển là môi trườngMS bổ sung 0,1 mg/l BAP + 0,5 mg/l indol 3 – butyric acid (IBA) và 2 g/lthan hoạt tính. Giá thể ra cây trong vườn ươm tốt nhất là rêu và sử dụngdinh dưỡng Hyponex 2 (20: 20: 20) bón tốt nhất cho cây A. formosanustrong vườn ươm [23].Nghiên cứu kĩ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng nhằm mục tiêu bảo tồnvà phát triển cây A. elatus Lindley, tác giả N. Ahamed Sherif và cộng sự(2012) đã sử dụng chồi đỉnh và chồi bên làm vật liệu nuôi cấy. Trên môi
Phạm Thị Nhung
11
trường MS có bổ sung 3,0 mg/l TDZ và 3,5 mg/l KI thích hợp nhất cho nhânnhanh cụm chồi. Tỷ lệ ra rễ đạt cao nhất khi bổ sung vào môi trường 0,3 g/lthan hoạt tính [16].Từ các kết quả trên cho thấy trên thế giới đã có nhiều công trình nghiêncứu đối với loài lan Kim tuyến. Các kết quả này có ý nghĩa quan trọng trongviệc giúp các nhà nghiên cứu nước ta kế thừa kinh nghiệm để đem lại hiệu quảcao trong việc nhân giống và bảo tồn lan Kim tuyến trong điều kiện Việt Nam.1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nướcCây lan Kim tuyến đang có nguy cơ tuyệt chủng do khai thác quá mức.Vì vậy, trong những năm gần đây, ở Việt Nam cũng đã có nghiên cứu về loàilan này nhằm phát triển và bảo tồn nguồn dược liệu quý.Phùng Văn Phê và cộng sự (2010) đã nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanhchồi in vitro lan Kim tuyến Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl. Kết quảcho thấy: môi trường phù hợp nhất để nhân nhanh chồi Lan Kim tuyến invitro là Knud*. Thể chồi 8 tuần tuổi từ phôi hạt chín và chồi từ thể chồi cao từ2-3 cm là phù hợp nhất để nhân nhanh trong môi trường thích hợp Knud* bổsung 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l KI + 0,3 mg/l NAA + 100 ml/l ND + 100 g/ldịch chiết khoai tây + 20 g/l saccarozơ + 7 g/l agar + 0,5 g/l than hoạt tính [9].Phùng Văn Phê và cộng sự (2010) đã nghiên cứu đặc điểm hình thái,phân bố của loài lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume ở vườn quốcgia Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc [10].Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (2012) đã nghiên cứu kỹ thuật nhângiống loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) in vitro bảo tồnnguồn dược liệu quý. Kết quả cho thấy: cơ quan vào mẫu phù hợp nhất làthể chồi và mắt đốt ngang thân được khử trùng và đưa vào các môi trườngnền khác nhau (MS, Knud, Knudson). Tiếp đó, các chồi và mắt đốt đượcchuyển sang môi trường nền thích hợp có bổ sung BAP, KI, α – NAA trong
Phạm Thị Nhung
12
4 tuần. Môi trường thích hợp nhất để nhân nhanh thể chồi và mắt đốt ngangthân là Knud* + 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l KI + 0,3 mg/l NAA + 20 g/lsaccarozơ + 0,5 g/l than hoạt tính + 7 g agar/l cho hệ số nhân chồi là 6,55chồi/mẫu. Các chồi có chiều cao từ 3 – 4 cm được sử dụng để ra rễ in vitro.Tỷ lệ ra rễ là 100% và số rễ/chồi (4,21 rễ/chồi) đạt cao nhất trên môi trườngcó bổ sung 1 mg/l α – NAA [13].Nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin và sự kết hợp giữa Kinetin và 2,4 D đến quá trình hình thành protocom-like bodies ở cây lan Kim tuyến(Anoectochilus setaceus Blume), tác giả Trần Thị Hồng Thúy và cộng sự(2014). Trong nghiên cứu này, chồi của cây lan Kim tuyến được sử dụnglàm nguyên liệu ban đầu để cảm ứng hình thành PLBs trong môi trườngKnudson C lỏng chứa 100 ml.L-1 nước dừa và bổ sung Kinetin hoặc sự kếthợp giữa Kinetin với 2,4-D. Kết quả cho thấy PLBs được hình thành tốt nhấttrên môi trường Knudson C lỏng chứa 1% saccarozơ, 100 ml.L-1 nước dừavà 0,5 mg.L-1 Kinetin, tỉ lệ hình thành PLBs đạt 86,25%, PLBs sinh trưởngtốt. Trong khi đó, sự kết hợp giữa 2,4-D ở nồng độ 0,5 mg.L-1 với một sốnồng độ của Kinetin (0,5; 1,0; 1,5 mg.L-1) không có tác dụng lớn trong việccảm ứng hình thành PLBs ở cây lan Kim tuyến [14].Ảnh hưởng của một số yếu tố lên quá trình sinh trưởng và phát triểncủa cây lan Gấm (Anoectochilus setaceus Blume) nuôi cấy in vitro, tác giảĐỗ Mạnh Cường và cộng sự (2015). Sau 2 tháng nuôi cấy, kết quả cho thấy,trên môi trường SH (Schenk and Hildebrandt, 1972) có bổ sung 1,0 mg/l BAcó sự khác biệt đáng kể về chiều cao chồi, khối lượng tươi và khối lượngkhô (6,70 cm; 1,41 g và 0,1751 g; tương ứng), đặc biệt số đốt (6,33 đốt/mẫu)đạt cao nhất so với các nghiệm thức khác. Sau đó, các đốt thân tiếp tục đượcnuôi cấy trên môi trường bổ sung 1,0 mg/l BAP kết hợp α-NAA ở các nồngđộ khác nhau nhằm tìm ra môi trường thích hợp cho quá trình sinh trưởng và
Phạm Thị Nhung
13
phát triển của chồi cây lan Gấm. Sau 2 tháng nuôi cấy, trên môi trường cóbổ sung 1,0 mg/l BAP kết hợp 1,0 mg/l α – NAA các chồi có sự sinh trưởngvà phát triển tốt (chiều cao chồi: 9,03 cm; số đốt: 9,33 đốt/mẫu; khối lượngtươi: 2,63 g và khối lượng khô: 0,2187 g), hệ rễ phát triển mạnh (số rễ: 7,33rễ/mẫu; chiều dài rễ: 1,36 cm). Tuy nhiên, mẫu bị nâu hóa do lượng phenoltrong mẫu tiết ra nhiều. Để tối ưu hóa môi trường, các điều kiện nuôi cấy:lỏng tĩnh, lỏng lắc, agar, bông gòn đã được khảo sát. Kết quả cho thấy, cácchồi trên môi trường lỏng có bông gòn sinh trưởng tốt, to khỏe, hệ rễ pháttriển mạnh và đặc biệt không còn hiện tượng nâu hóa [5].Từ các kết quả trên cho thấy ở Việt Nam cũng đã có nhiều nghiên cứuvề việc nhân giống và bảo tồn lan Kim tuyến. Tuy nhiên, việc nghiên cứunày mới chỉ dừng lại ở một số đối tượng và chưa hoàn thiện được kỹ thuậttrồng, chăm sóc đầy đủ. Các kết quả nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở mức độnghiên cứu trong phòng thí nghiệm, chưa được áp dụng vào sản xuất.
Phạm Thị Nhung
14
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu thực vậtCây lan Kim tuyến in vitro do Phòng Sinh lý thực vật, Khoa Sinh KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 cung cấp.2.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm2.2.1. Dụng cụDao cấy, khay cấy, kéo, túi nilon, bình tam giác, đèn cồn, bình xịt cồnvỉ xốp nuôi cấy,…2.2.2. Thiết bịCác thiết bị sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật: cân kĩ thuật, máy đopH, nồi hấp khử trùng, máy cất nước hai lần, buồng cấy vô trùng, máykhuấy từ ra nhiệt,…2.3. Môi trường nuôi cấyCác thí nghiệm nuôi cấy in vitro đều sử dụng môi trường dinh dưỡngcơ bản (Murashige và Skoog, 1962) [20]: MS + 30 g/l đường saccarozơ + 7g/l agar và các chất điều hòa sinh trưởng.pH môi trường: 5,8Môi trường được khử trùng trong nồi hấp khử trùng ở nhiệt độ 117oCtrong 15 phút.2.4. Điều kiện nuôi cấy in vitroCác thí nghiệm đều được thực hiện trong điều kiện nhân tạo.Thời gian chiếu sáng: 16 giờ sáng/8 giờ tối.Nhiệt độ: 25 ± 2o C.Độ ẩm: 70 – 80%Cường độ ánh sáng: 2000 lux.
Phạm Thị Nhung
15
2.5. Phương pháp nghiên cứu2.5.1. Bố trí thí nghiệmNghiên cứu được tiến hành gồm 3 thí nghiệm, các thí nghiệm được bốtrí theo sơ đồ hình 2.1.Cây lan Kim tuyến in vitro+ BAP
+ Kinetin
Nhân nhanh lan Kim tuyến+ NAATạo cây lan Kim tuyến in vitro hoàn chỉnh
+ Xơ dừa, đất, phân bòRèn luyện cây in vitro ngoài môi trường tự nhiênHình 2.1. Sơ đồ nghiên cứuCác thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lầnnhắc lại.2.5.2. Phương pháp nghiên cứu2.5.2.1. Thí nghiệm 1: Hoàn thiện giai đoạn nhân nhanh lan Kim tuyến bằngkỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vậtThí nghiệm tiến hành trên môi trường cơ bản: MS + 30 g/l đường, 7 g/lagar có bổ sung KI và BAP với nồng độ như sau:
Phạm Thị Nhung
16