Lan Trầm Rừng Vàng

Tổng hợp các bài viết thuộc chủ đề Lan Trầm Rừng Vàng xem nhiều nhất, được cập nhật mới nhất ngày 18/01/2021 trên website Inkndrinkmarkers.com. Hy vọng nội dung bài viết sẽ đáp ứng được nhu cầu của bạn, chúng tôi sẽ thường xuyên cập nhật mới nội dung Lan Trầm Rừng Vàng để bạn nhận được thông tin nhanh chóng và chính xác nhất. Cho đến thời điểm hiện tại, chủ đề này đã đạt được 2.277 lượt xem.

Có 187 tin bài trong chủ đề【Lan Trầm Rừng Vàng】

【#1】Chiêm Ngưỡng Top 10 Loại Hoa Lan Đẹp Nhất Việt Nam 2021

Các loại hoa phong lan đẹp mang trong mình một điều bí ẩn, sức hút hấp dẫn làm mê mẫn người chơi. Bởi mang trong mình hình ảnh đẹp và độc đáo nên hoa lan được xem như nữ hoàng các loài hoa.

Hoa lan là một trong những sản vật của tạo hóa, là tác phẩm nghệ thuật tuyệt tác mà thiên nhiên ban tặng cho con người. Hoa phong lan có vẻ đẹp, sức hấp dẫn người chơi đến kỳ lạ. Có thể nói hoa lan hội tụ tất cả các đặc điểm quý của các loài hoa đẹp như màu sắc đẹp, phong phú, cấu tạo hoa đa dạng, tinh tế, hoa có độ bền lâu và đặc biệt hấp dẫn người chơi bởi hương thơm quyến rũ.

Chiêm ngưỡng vẻ đẹp của hoa phong lan, tâm hồn con người như được giao hòa cùng thiên nhiên. Các bậc cao niên thời xưa cho rằng: hoa phong lan mang tất cả các tính cách thanh cao của người quân tử, đó là: nhân, lễ, nghĩa, trí, tín.

Tại sao hoa lan lại hội tụ tất cả các đặc điểm quý của các loài hoa khác và được coi như nữ hoàng của các loài hoa?

Câu trả lời nằm ở cấu tạo đặc biệt của hoa phong lan. Hoa lan có 3 cánh đài, 3 cánh tràng, 1 trong 3 cánh tràng biến dạng thành hình lưỡi có 3 thùy gọi là cánh môi, 3 cánh đài giống với 2 cánh tràng còn lại tạo thành bông hoa có 5 cánh và một cánh môi. Nhờ đặc điểm cánh hoa ấn tượng đã tạo nên một loài hoa lan đẹp, quyến rũ.

Đầu trục hoa là nhị đực chứa 2 hạt phấn được bao phủ bởi nắp bao phấn rất chặt chẽ. Dưới nhị đực là nhụy có hình lõm và có nhiều chất nhày khi hoa nở để sẵn sàng kết dính và tiếp nhận hạt phấn.

Do đặc điểm của hầu hết các loài lan là khả năng tự thụ phấn kém (nguyên nhân là do nắp bao phấn đóng rất chắc và hạt phấn không tiếp cận được với nhụy hoa) nên không thể xảy ra quá trình thụ phấn mà phải nhờ đến các loài côn trùng lớn như ong, bướm…đến thụ phấn cho hoa. Chính bởi sự giao phấn ngẫu nhiên này đã tạo cho hoa phong lan nhiều đặc tính quý giá: hoa có nhiều hình dáng đẹp, cấu tạo hoa phong phú, màu sắc hấp dẫn và hương thơm ngọt ngào quyến rũ.

Có tên khoa học là Dendrobium Lituiflorum, thân cây khá lớn so với các loại lan đẹp khác, thường rủ xuống khi cây dần trưởng thành. Độ dài trung bình của thân cây rơi vào 50-80 cm.

Loài lan rừng quý hiếm này nở hoa vào cuối mùa đông hàng năm, nở theo chùm khá lớn, rất thơm và lâu tàn. Kích thước của mỗi bông khoảng 6-7 cm, một chùm nhỏ có 2-3 bông.

Là một trong các loại lan rừng đẹp dễ trồng hiện nay nhưng còn tùy vào thời tiết mỗi nơi. Có thông tin cho rằng mỗi cây hoa Thảo Kèn có giá từ 2 – 3 triệu đồng. Chính vì sự đắt đỏ và quý hiếm của loài hoa phong lan rừng này mà người ta đã có ý định nuôi cấy đại trà để giảm thiểu mật độ săn lùng.

Việc chơi lan và trồng lan là cả một nghệ thuật đòi hỏi sự khó khăn cũng như tự hào. Chính vì thế mà không có công thức chung nào cố định cả. Lan giả hạc là một loại lan đẹp độc đáo với cách trồng không quá khó.

giúp nhà vườn nâng hạ và di chuyển nhanh chóng các chậu hoa, chậu cảnh.

Thuộc danh sách các loại lan rừng quý hiếm năm 2021 ở Việt Nam, lan Trầm vàng có vẻ đẹp rực rỡ và quyến rũ người xem. Loại hoa lan rừng đẹp này có mùi thơm khá nồng nàn chứ không thoang thoảng như các loài hoa khác.

Lan Trầm vàng thường trồng trong chậu nhỏ chứ không gán vào thân gỗ. Khi trưởng thành cây có kích thước khá nhỏ, lá to, dẹt và dài. Hoa nở vào tháng 3 – 5 hàng năm. Bông hoa có độ lớn trung bình, màu vàng rực, hơi bóng nhẹ ở phía trong cánh hoa và có màu nâu nổi bật ở nhụy hoa.

Các loại hoa lan đẹp và quý như Trầm vàng cần sự chăm sóc đặc biệt. Không nên tưới nước quá nhiều vì đất trồng lan là đất ẩm, chỉ nên tưới 1 tuần 2 lần dưới dạng phun sương. Tuy chăm sóc khó khăn nhưng khi nhìn thấy bông hoa đầu tiên nở bạn sẽ hiểu tại sao lại có những người yêu hoa đến vậy.

– Tại nơi trồng, nên đảm bảo nhiệt độ, ánh sáng phù hợp. Tốt nhất tránh để chậu lan tiếp xúc trực tiếp dưới ánh nắng mặt trời khiến cây cháy lá và chậm lớn. Nên đặt chậu ở nơi có độ ẩm 70 – 90 % và nhiệt độ 18-25 độ để cây phát triển tốt. Đến khi lan trầm ra hoa, nhiệt độ cần giữ ở mức 13-15 độ và duy trì trong khoảng 4-6 tuần.

– Về phân bón, bạn nên bón mỗi tuần một lần hàm lượng phân bón NPK theo tỉ lệ 30-10-10 hay 20-20-20 đầy đủ cho cây. Nếu cây có dấu hiệu úa vàng, chuẩn bị rụng lá thì chuyển sang tỉ lệ 10-30-20 để kích thích cây ra nụ.

Bởi lan trầm vàng không chỉ đẹp mà còn có hương thơm nhẹ nhàng, dễ chịu; còn gì thích bằng khi mỗi sớm mai thức dậy, bạn lại được nhìn thấy những chậu lan trầm vàng do chính tay mình trồng và chăm sóc mỗi ngày trổ ra những bông hoa rực rỡ.

Hoa lan Nghinh Xuân còn có tên gọi khác là hoa lan Lai Châu hay Ngọc Điểm, là một trong những các hoa đẹp nhất, được ưa chuộng ở Việt Nam. Thông thường, trước tết khoảng 2 tháng nghinh xuân bắt đầu đâm nụ hoa.

Là một loại hoa phong lan rễ gió trồng không cần giá thể chỉ cần có nơi để cây bám là được. Đa phần có màu trắng và tím, tuy nhiên hàng ngoại nhập có thể có màu tím, vàng tạo nên một loại hoa lan đẹp, đậm nét đặc trưng… Nghinh xuân là loại hoa lan có mùi rất thơm dễ chịu đặc biệt thích hợp chưng những ngày Tết.

Tháng 11 âm lịch: Chồi non của lan Ngọc Điểm 1 – 2 cm

– Giai đoạn này cần theo dõi sự phát triển của chồi hoa. Đồng thời, theo dõi bệnh, nấm, nhện, kiến….

– Thông thường Ngọc điểm nở hoa vào cuối mùa đông hay đầu mùa xuân và vào dịp Tết Nguyên Đán. Khi thấy lan ra nụ, hãy phun nước hoặc tăng thêm độ ẩm hoặc tưới sơ qua. Muốn lan nở sớm hơn hãy tăng thêm nhiệt độ hay là mang vào trong nhà để dưới ánh đèn, nhưng cần thoáng gió và độ ẩm.

Nếu muốn lan chậm nở hãy mang vào chỗ rợp mát, vào phòng lạnh hoặc để nước đá ở gần, nhưng đừng cho vào gốc hay để rễ chạm vào.Tăng giảm nhiệt độ khá khó khăn với những người chơi lan tài tử, nhưng đối với nhà vườn có đủ hệ thống điều hòa nhiệt độ thì việc này chẳng có gì khó.

Đây là một trong các loại lan rừng đẹp nhất Việt Nam được nhiều dân chơi lan săn đón. Có 4 loại lan Tuyết Nhung, người ta chia tên các loại hoa lan ở Việt Nam này dựa theo hình thái và màu sắc của nó: Tuyết Nhung Giún (Dạ Vỹ), Tuyết Nhung Vàng (Hoàng Nhung), Tuyết Nhung Trơn (Phượng Vỹ) và Tuyết Nhung Việt – được tìm thấy tại Hà Giang.

Đa phần lan Tuyết Nhung có màu đỏ, chỉ riêng Tuyết Nhung Vàng là có màu sắc khác. Tùy theo mỗi loại mà chiều dài thân cây có thể lên đến 2 – 5 m. Cánh hoa nhỏ, dài, nở tung khắp phía. Người chơi lan thường trồng loại cây này ở nơi có bóng râm, thoáng mát và luôn để ý độ ẩm.

– Chế độ ánh sáng: Đưa cây lan phượng vĩ ra ngoài để cây chịu hoàn toàn ánh sáng tự nhiên.

– Chế độ tưới nước: Cắt nước hoàn toàn trong mùa đông.

– Chế độ phân bón: Không bón phân trong mùa đông.

– Môi trường yêu cầu: Môi trường phải hanh, khô, nhiều gió, ánh sáng là 100% ánh sáng tự nhiên.

Thuộc các loại lan đẹp nổi bật có bông rất dày cánh và rất lâu tàn, hoa cẩm báo có nền màu vàng và các đốm màu nâu nhìn như da báo nên có tên hoa lan là cẩm báo. Nó có bộ rễ rất gió khoẻ, vươn ra ngoài hút độ ẩm trong không khí để sống. Hoa phong lan Cẩm báo không cần giá thể, dễ trồng.

Nhận diện lan cẩm báo bằng dấu hiệu như lá rất to bằng bàn tay và mọng nước, các rễ rất to không mọc trong chậu mà phun ra ngoài. Cẩm báo ra bông to và lâu tàn có thể đến 3 tuần mới tàn trong tự nhiên có một loài lan rất giống cẩm báo là lan râu mực.

cẩm báo đúng cách: Lan cẩm báo có bộ rễ khá dày và nhiều. Cây ưa ánh sáng dồi dào và môi trường thông thoáng khô ráo. Cây thích hợp nhất là được trồng trong những giá thể gỗ lũa được ghép thêm rễ dương xỉ và vỏ thông lớn dễ thoát nước, nhiệt độ nóng ấm, mùa hè tưới nuớc hàng ngày và bón phân hàng tuần.

Chăm sóc hoa phong lan cẩm báo: Lan cẩm báo thích hợp với điều kiện khí hậu khoảng từ 25-30 độ C. Các chậu lan này nên được trồng với độ ẩm cao tuy nhiên ẩm độ trong chậu cần được thoáng mát. Lan cẩm báo thuộc giống ưa sáng.

Trên thực tế môi trường giàu ánh sáng sẽ khiến cho lan nở hoa to và đẹp hơn. Cường độ ánh sáng nên ở mức 60% sáng là thích hợp nhất. Lan cẩm báo là một trong số những loại giống cây có nhu cầu về loại phân bón khá cao. Nên phòng ngừa sâu bệnh cho lan bằng cách định kì phun các loại thuốc ngừa nấm như , Benomyl nồng độ 1/400 khoảng nửa tháng 1 lần.

Lan Kim Tuyến Sapa có thân bò dài khoảng 12 – 20 cm, lá cây có màu đỏ nhạt cùng các gân nhỏ màu hồng. Cụm hoa nhỏ bao gồm các bông hoa hồng nhạt kết vào nhau. Có câu nói ngụ ý rằng chơi lan thì chơi lá rồi mới chơi hoa. Bởi vậy lan Kim Tuyến Sapa được săn đón nhờ vào hình thái lá rất đẹp.

Hoa thường nở vào tháng 10 – 12 hàng năm, ra chồi rồi hạt để tái sinh. Có thể tìm thấy hoa ở trong rừng sâu với độ cao 1500 – 1800 m. Khi chăm sóc lưu ý đến độ ẩm của cây vì lan là loài rất nhạy cảm, dễ sinh bệnh.

Đối với lan kim tuyến cách tốt nhất để phòng trừ sâu bệnh cho cây là phải đảm bảo độ ẩm cũng như các chất dinh dưỡng đầy đủ cho cây. Ngoài ra, bạn cũng nên thường xuyên kiểm tra hiện trạng của lan để phát dấu hiệu bệnh kịp thời, từ đó có cách phòng trị hiệu quả.Loại bỏ ngay những cây đã bị nhiễm bệnh để tránh lan sang các cá thể khác.

Về hình dáng thân lan có vùng bìu cũng như vùng thắt tạo thành hình giống như chuỗi phật trong phật giáo. Hoa trúc phật bà rất đẹp cánh hoa rất bay màu trắng tự nhiên dược bao bọc bởi viền màu tím, nhuỵ hoa rất tươi thể hiện sự trường tồn tạo nên tổng thể mặt hoa rất đẹp.

Khi trồng loài hoa lan đẹp này cần chú ý: giá thể trồng lan phật bà thường là vỏ thông trộn xơ dừa. Khi trồng nên để bộ rễ nằm trên giá thể vì nó không chịu được độ ẩm quá cao dễ gây bệnh trên cây.

– Sau khi đã có những cây lan Trúc Phật Bà ta tiến hành xử lý những cây khi mới mua về và bắt đầu ghép những cây lan Trúc Phật Bà vào gỗ hoặc chậu và đặt ở vị trí cố định.

– Tưới nước cho cây đủ ẩm và để cây ở khu vực có ánh nắng vừa phải để cây ra bộ rễ mới và phát triển.

– Ở khu vực miền bắc cây cần giữ độ ẩm tốt hơn và cần bổ sung lượng nước vừa phải, khi ở miền bắc khi có gió lạnh ta cần giảm lượng nước và cắt nước cho tới khi cây ra chồi mới, ta mới tiến hành chăm sóc tiếp.

Đây là một cái tên trong các loại hoa phong lan đẹp nhất hiện nay, được dùng làm cây cảnh trong những gia đình yêu hoa, thiên nhiên. Cây được tìm thấy ở Lâm Đồng trên độ cao 1400 – 2150 mét nên rất khó để sở hữu được lại hoa này.

Hoa mọc thành từng bông nhỏ, màu trắng pha một chút xanh lá phần cuống hoa. Thân cây khá to nên được dùng làm cây cảnh khá nhiều. Tuy nhiên do tình trạng săn bắt cao nên dần trở nên ít đi và có nguy cơ bị tuyệt chủng như các giống lan rừng quý hiếm khác.

Có một lưu ý nhỏ với những người chơi lan lần đầu đó là lan rừng hiện nay thường được ghép và nuôi tại vườn nên không phải chậu hoa nào cũng giữ được vẻ đẹp nguyên thủy của chúng. Là một người chơi lan lâu năm nhất định phải hiểu lan rừng đẹp nhất khi nó được ở đúng nơi – rừng sâu.

Tại Việt Nam, suốt mùa mưa từ tháng 4-6 cây lan lúc nào cũng ướt đẫm và lại rất khô vào mùa đông. Theo quy luật chung, tưới nhiều khi cây non mọc và bớt tưới vào mùa thu khi cây đã ngưng tăng trưởng. Mùa đông chỉ tưới sơ qua hoặc phun nước vào buổi sáng.

Khi thấy củ bị nhăn nheo hay lá bị héo, đó là dấu hiệu của sự thiếu nước và thiếu độ ẩm. Trái lại nếu củ lúc nào cũng mập tròn sẽ không ra hoa.Đừng bao giờ để lan bị khô rễ vào mùa hè và mùa xuân bắt đầu tưới trở lai khi thấy mọc rễ mới hay ra mầm non.

Bón phân 30-10-10 với dung lượng ¼-½ thìa cà phê cho 4 lít nước và đổi sang 10-30-20 khi bắt đầu mùa thu, hay có thể dùng phân 15-15-15 quanh năm với liều lượng như trên. Lan không ưa bị đọng muối trong chậu, cho nên mỗi tháng cần xả nước một lần cho sạch, tức là tưới như thường lệ và 1-2 giờ sau tưới thêm một lần nữa, rồi mới bón phân. Khi cây mọc mạnh bón mỗi tuần một lần, khi cây ngưng tăng trưởng bón mỗi tháng một lần.

Đặc điểm nổi bật nhất của cây phi điệp 5 cánh trắng chính là mặt bông hoa. Theo đó, khuôn bông có vẻ đẹp hài hoà, cánh đỉnh cao, vươn thẳng, đầu cánh hơi cong, hai cánh vai ngang, xếp đều nhau. Bên trong, môi hoa có hình tim, có nhung tuyết ở bờ môi và hai mắt nổi rõ màu tím.

Khác với các loại phi điệp thông thường các cánh hoa có màu tím, năm cánh của loại phi điệp này có màu trắng, trong như ngọc. Đặc biệt, sau khi nở từ 3 – 5 tiếng, hoa lan toả mùi hương rất quyến rũ, dễ chịu, thoang thoảng nhưng bay xa và có thể lôi kéo lòng người…

Vào mùa hè, lan phát triển manh cho nên tưới 2 đến 4 lần/ tuần. Vào mùa thu, bạn quan sát thấy cây tăng trưởng chậm thì tưới nước ít lại, giảm mức độ tưới xuống 1 lần/tuần để cây không thiếu nước và teo lại.

Mùa đông là thời gian lan chuẩn bị để ra hoa, hãy ngưng hẳn việc tưới nước. Nếu ẩm độ quá thấp nên phun sương mỗi tháng 1-2 lần.

– Ánh sáng:

Lan phi điệp cần nhiều ánh sáng gần như có thể để ở ngoài trời, nhưng cần phải có lưới che phòng khi lá non bị cháy nắng. Khi thấy cây quặt quẹo, đó là dấu hiệu thiếu nắng. Hãy đưa cây ra chỗ có nhiều nắng hơn. Nhất là vào mùa đông, nếu thiếu nắng cây khó lòng ra hoa.

– Nhiệt độ:

Lan cần nuôi trong nhiệt độ từ 40-80°F hay 8-25°C. Tuy nhiên, lan có thể chịu nóng tới 100°F hay 38°C và có thể chịu lạnh tới 38°F hay 3.3°C. Ngoài ra nếu vào mùa đông không lạnh dưới 50°F hay 15.6°C trong vòng 4-6 tuần lan sẽ khó lòng ra nụ.

– Đổ ẩm:

Lan phi điệp mọc mạnh nếu ẩm độ cần phải từ 60-70%. Nếu quá thấp cây non sẽ không lớn được và bị teo đi.

– Độ thoáng gió:

Cây cũng không mọc mạnh nếu không thoáng gió và trong thời kỳ lan ra nụ nếu không thoáng gió nụ sẽ ít đi.


【#2】Luận Văn: Nghiên Cứu Nhân Nhanh In Vitro Loài Lan Kim Tuyến, 9Đ

Published on

Download luận văn thạc sĩ ngành sinh học thực nghiệm với đề tài: Nghiên cứu nhân nhanh in vitro loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) nhằm bảo tồn nguồn dược liệu quý, cho các bạn tham khảo

  1. 3. LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực tập tốt nghiệp và hoàn thành luận văn, em đã nhận được sự giúp đỡ về nhiều mặt của các cấp lãnh đạo, các tập thể và các cá nhân. Trước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến chúng tôi Nguyễn Trung Thành, thầy đã luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này. Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy chúng tôi Nguyễn Quang Thạch và toàn thể tập thể cán bộ phòng Công nghệ tế bào Thực vật, viện Sinh học Nông nghiệp, Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện về cơ sở vật chất, chia sẻ kinh nghiệm quý báu để em hoàn thành tốt đề tài này. Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới gia đình, người thân và bạn bè đã cổ vũ, động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 5 tháng 12 năm 2012 Học viên Phí Thị Cẩm Miện
  2. 4. DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BAP 6-benzylaminopurin CT Công thức CV% Hệ số biến động (Correlation of Variance) ĐC Đối chứng IBA indol-3-acetic acid MS Murashige và Skoog, 1962 LSD0,05 Sai khác tối thiểu có ý nghĩa ở P – 0,5 (Leant Significant Difference) ND Nước dừa αNAA α-naphthylacetic acid
  3. 5. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN………………………………………………………………………………………. 1 MỤC LỤC …………………………………………………………………………………………… 5 MỞ ĐẦU …………………………………………………………………………………………….. 7 1.1. Đặt vấn đề ……………………………………………………………………………………… 7 CHƯƠNG I………………………………………………………………………………………….. 8 TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………………………………………………….. 8 1.1. Giới thiệu chung về cây Lan Kim tuyến ……………………………………………… 8 1.1.1. Đặc điểm hình thái ……………………………………………………………………….. 9 1.1.2. Đặc điểm phân bố……………………………………………………………………….. 11 1.2. Nhân giống cây Lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus) ……………………. 13 1.2.1. Nhân giống bằng hạt …………………………………………………………………… 13 1.2.2. Nhân giống bằng cây con …………………………………………………………….. 13 1.2.3. Phương pháp giâm cây………………………………………………………………… 14 1.2.4. Nhân giống in vitro……………………………………………………………………… 14 1.2.4.1. Cơ sở khoa học của nhân giống in vitro ………………………………………. 14 1.2.4.2. Ý nghĩa của nhân giống in vitro………………………………………………….. 15 1.2.4.3. Các phương thức nhân giống vô tính…………………………………………… 18 1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy……………………………………………………. 18 1.3.1. Ảnh hưởng của điều kiện khử trùng mẫu cấy…………………………………… 18 1.3. 2. Ảnh hưởng của các thành phần hóa học………………………………………… 19 1.3. 3. Ảnh hưởng của các yếu tố vật lý…………………………………………………… 23 1.3.4. Ảnh hưởng của điều kiện ra cây ……………………………………………………. 24 1.4. Quy trình sản xuất cây cấy mô…………………………………………………………. 25 1.5. Tình hình nghiên cứu trên cây Lan Kim tuyến……………………………………. 26 1.5.1.Tình hình nghiên cứu trên thế giới………………………………………………….. 26 1.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước…………………………………………………… 27 CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………………. 28 2.1. Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu …………………………. 28 2.2. Mục tiêu nghiên cứu………………………………………………………………………. 28 2.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn …………………………………………………………. 29
  4. 6. 2.4. Nội dung nghiên cứu ……………………………………………………………………… 29 2.5. Phương pháp nghiên cứu………………………………………………………………… 29 2.5.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm……………………………………………………… 30 2.5.2. Phương pháp đánh giá kết quả và xử lý số liệu………………………………… 35 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……………………………………….. 39 3.1. Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu sạch và xác định cơ quan vào mẫu phù hợp cho việc nhân nhanh in vitro…………………………………………… 39 3.1.1. Xác định chất khử trùng thích hợp …………………………………………….. 39 3.1.2. Xác định cơ quan vào mẫu thích hợp để tạo mẫu sạch và tăng hệ số nhân chồi in vitro……………………………………………………………………………….. 42 3.1.2.1. Ảnh hưởng của loại vật liệu đến tỷ lệ tạo mẫu sạch……………………….. 42 3.1.2.2. Ảnh hưởng của cơ quan vào mẫu đến hệ số nhân chồi in vitro ……….. 44 3.2. Nghiên cứu môi trường khởi động và nhân nhanh thích hợp…………… 45 3.2.1. Xác định môi trường nền thích hợp cho nuôi cấy mô Lan Kim tuyến (A. setaceus) ……………………………………………………………………………………………. 45 3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất điều hòa sinh trưởng riêng rẽ và phối hợp đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân…………………………………….. 47 3.2.2.1. Ảnh hưởng của nhóm chất Cytokinin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân………………………………………………………………………………………………….. 47 3.2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA và αNAA đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân Lan Kim tuyến (A. setaceus)………………………………………………….. 50 3.2.2.3.Ảnh hưởng của sự phối hợp 2 nhóm chất là auxin và cytokinin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân…………………………………………………………… 53 3.3. Nghiên cứu ra rễ tạo cây hoàn chỉnh…………………………………………………. 56 3.3.1. Ảnh hưởng của môi trường nền (môi trường không có chất điều tiết sinh trưởng) đến sự ra rễ…………………………………………………………………………….. 56 3.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến sự ra rễ…………………….. 58 CHƯƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ …………………………………………… 67 4.1. Kết luận………………………………………………………………………………………. 67 4.2. Đề nghị ……………………………………………………………………………………….. 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………………………….. 69 PHỤ LỤC ………………………………………………………………………………………….. 75
  5. 7. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Từ xưa đến nay, lan vẫn được biết đến như một loài hoa quý phái, hoa của bậc vua chúa vương giả. Lan được phát hiện đầu tiên vào những năm 40 của thế kỷ VIII, cho đến nay đã có hơn 15.000 loại lan trồng khác nhau trên trên thế giới. Tại Việt Nam, hoa lan cũng vô cùng đa dạng phong phú, có khoảng hơn 1.000 loài hoa các loại, chúng sinh sản tại các vùng rừng, núi như Cao Bằng, Lào Cai, Huế, Quy Nhơn, Đà Lạt, Pleiku, … lan Việt Nam đẹp thanh cao lại chứa đựng nhiều ý nghĩa, có rất nhiều cây quý hiếm và có những cây trước kia chỉ thấy mọc ở Việt Nam (như lan nữ hài Paphiopedilum delenati). Họ lan (Orchidaceae) là một trong số những họ thực vật đa dạng nhất của Việt Nam, với tổng số khoảng 865 loài thuộc 154 chi. Thông thường lan được sử dụng làm cảnh. Ngoài ra, có nhiều loài lan còn được sử dụng làm thuốc. Chi lan Kim tuyến Anoectochilus ở Việt Nam hiện thống kê được 12 loài, trong đó có loài lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume, tên khác Anoectochilus roxburghii Wall. ex Lindl. phân bố rộng ở hầu hết các tỉnh trong cả nước, được biết đến nhiều không những bởi giá trị làm cảnh, mà bởi giá trị làm thuốc của nó. Do bị thu hái nhiều để bán làm thuốc từ rất lâu, nên loài lan Kim tuyến đang bị đe dọa nghiêm trọng, rất có thể sẽ bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên nếu chúng ta không có biện pháp bảo tồn hữu hiệu. Hiện nay, lan Kim tuyến được cấp báo trong Nghị định 32/2006/NĐ-CP thuộc nhóm IA, nghiêm cấm khai thác sử dụng vì mục đích thương mại và nhóm thực vật rừng đang nguy cấp EN A1a,c,d, trong sách đỏ Việt Nam 2007. Vì vậy, nghiên cứu kỹ thuật nhân giống loài lan Kim tuyến – Anoectochilus setaceus Blume được triển khai sẽ cung cấp những cơ sở khoa học và thực tiễn để tạo ra hàng loạt những cây con ổn định về mặt di truyền nhằm bảo tồn và phát triển loài dược liệu nguy cấp, quí hiếm này. Xuất phát từ những cơ sở đó, chúng tôi đã lựa chọn và thực hiện nghiên cứu đề tài:”Nghiên cứu nhân nhanh in vitro loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) nhằm bảo tồn nguồn dược liệu quý”.
  6. 8. CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về cây Lan Kim tuyến Chi lan Kim tuyến (Anoectochilus) còn được gọi là lan trang sức vì vẻ đẹp hấp dẫn của nó, được Carlvon Blume mô tả đầu tiên năm 1810 thuộc phân họ Orchidoideae. Trên thế giới đã thống kê được 51 loài. Ở Việt Nam hiện thống kê được 12 loài, trong đó loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) được biết đến chủ yếu với công dụng làm thuốc. Lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) Đồng danh là (Anoectochilus roxburghi Wall.) Họ: Phong lan (Orchidaceae) Bộ: Phong lan (Orchidales) Đây là loài đơn thân, mọc ở đất, có thân rễ mọc dài; thân trên đất mọng nước và có nhiều lông mềm, mang 2 – 4 lá mọc xoè sát đất. Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, chóp hơi nhọn và có mũi ngắn, cỡ 3 – 4 x 2 – 3 cm, mặt trên màu nâu thẫm có vệt vàng ở giữa và màu hồng nhạt trên các gân, mặt dưới màu nâu nhạt. Cuống lá dài 2 – 3 cm. Cụm hoa dài 10 – 15 cm, mang 4 – 10 hoa mọc thưa. Lá bắc hình trứng, dài 8-10 mm, màu hồng. Hoa thường màu trắng, dài 2,5 – 3 cm; môi dài đến 1,5 cm, ở mỗi bên gốc mang 6 – 8 dải hẹp, chẻ đôi thành 2 thuỳ hình thuôn tròn. Bầu dài 13mm, có lông thưa. Mùa hoa tháng 2, tháng 4. Tái sinh bằng chồi từ thân rễ và hạt ít, sinh trưởng rất chậm. Là loại cây ưa bóng, kỵ ánh sáng trực tiếp thường mọc dưới tán rừng nguyên sinh, rừng rậm nhiệt đới ở độ cao 500 – 1600m. Mọc rải rác vài ba cây trên đất ẩm, giàu mùn và lá cây rụng. Phân bố: Việt Nam: Lào Cai (Sapa), Hà Giang (Quản Bạ), Yên Bái, Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Hà Tây (Mỹ Đức: Chùa Hương), Quảng Trị (Đồng Chè), Kontum (Đắc Tô: Đắc Uy), Gia Lai (Kbang: Kon Hà Nừng)….Thế giới: Trung Quốc (Vân Nam, Quảng Đông), Ấn Độ, Lào, Inđônêxia,… Tác dụng dược lý: Lan Kim tuyến là loài cây thuốc rất đặc biệt có tác dụng tăng cường sức khoẻ, làm khí huyết lưu thông, có tính kháng khuẩn, chữa các bệnh viêm khí quản, viêm gan mãn tính, chữa suy nhược thần kinh. Loài lan này được dùng làm thuốc chữa bệnh trị lao phổi, phong thấp, đau nhức khớp xương, viêm dạ dày mãn tính (Nguyễn Tiến Bân, Dương Đức Huyến). Trước đó, lan Kim tuyến (A. setaceus) là một trong những dược thảo quý giá, giúp bổ máu,
  7. 9. dưỡng âm, chữa trị nóng phổi và nóng gan (Tạ A Mộc và Trần Kiến Đào, 1958). Hơn nữa mới đây người ta đã phát hiện ra khả năng phòng và chống ung thư của loại thảo dược này. Theo các tài liệu nghiên cứu của Trung Quốc công bố gần đây bằng kỹ thuật sắc ký lỏng, sắc ký cột và kỹ thuật quang phổ đã phân lập, xác định được cấu trúc hoá học và thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất có trong loài lan Kim tuyến (Tạp chí “Sinh học thực vật tổng hợp Trung Quốc”, tập 48 số 3, tháng 3/2006, trang 359-363). Bằng các kỹ thuật quang phổ đã xác định được 8 hợp chất hoá học. Các hợp chất này đều có hoạt tính sinh học mạnh, có khả năng làm giảm các gốc tự do trong cơ thể, nên có khả năng phòng bệnh rất tốt. Đặc biệt có hai axít hữu cơ được phân lập là Olenolic acid và Ursolic acid có khả năng chống ung thư, giảm cholesterol máu, chống tăng huyết áp, kháng khuẩn… 1.1.1. Đặc điểm hình thái Lan Kim tuyến là cây thảo, mọc ở đất, có thân rễ mọc dài; thân trên đất mọng nước, mang các lá mọc xòe sát đất. a. Thân rễ Lan Kim tuyến là cây thân rễ nằm ngang sát mặt đất, đôi khi hơi nghiêng, bò dài. Chiều dài thân rễ từ 5-12 cm, trung bình là 7,87 cm. Đường kính thân rễ từ 3-4 mm, trung bình là 3,17 mm. Số lóng trên thân rễ từ 3-7 lóng, trung bình là 4,03 lóng. Chiều dài của lóng từ 1-6 cm, trung bình là 1,99 cm. Thân rễ thường có màu xanh trắng, đôi khi có màu nâu đỏ, thường nhẵn, không phủ lông. b. Thân khí sinh Cây lan Kim tuyến có thân khí sinh thường mọc thẳng đứng trên mặt đất, ít khi mọc nghiêng. Chiều dài thân khí sinh từ 4-8 cm, trung bình 6 cm. Đường kính thân khí sinh từ 3- 5 mm, trung bình là 3,08 cm. Thân khí sinh mang nhiều lóng, các lóng có chiều dài khác nhau. Số lóng trên thân khí sinh thay đổi từ 2-4 lóng, trung bình là 2,87. Chiều dài mỗi lóng từ 1-4 cm, trung bình 2,23 cm. Thân khí sinh thường mọng nước, nhẵn, không phủ lông; thường có màu xanh trắng, đôi khi có màu hồng nhạt. c. Rễ Rễ lan Kim tuyến được mọc ra từ các mẫu trên thân rễ. Đôi khi rễ cũng được hình thành từ thân khí sinh. Rễ thường đâm thẳng xuống đất. Thông thường mỗi mẫu chỉ có một rễ, đôi khi có vài rễ cùng được hình thành từ một
  8. 10. mấu trên thân rễ. Số lượng và kích thước rễ cũng rất thay đổi tuỳ theo cá thể. Số rễ trên một cây thường từ 3 – 10, trung bình là 5,4. Chiều dài của rễ thay đổi từ 0,5 – 8 cm, rễ dài nhất trung bình là 6,07cm và ngắn nhất trung bình là 1,22 cm, chiều dài trung bình của các rễ trên một cây là 3,82 cm. d. Lá Lá lan Kim tuyến mọc cách xoắn quanh thân, xoè trên mặt đất. Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, đầu lá hơi nhọn và có mũi ngắn, thường dài từ 3 – 5 cm, trung bình là 4,03 cm và rộng từ 2 – 4 cm, trung bình là 3,12 cm. Lá có màu nâu đỏ ở mặt trên và phủ lông mịn như nhung. Hệ gân lá mạng lưới lông chim, thường có 5 gân gốc. Các gân này thường có màu hồng ở mặt trên và nổi rất rõ. Đôi khi gân ở giữa có màu vàng nhạt. Mặt dưới lá có màu nâu đỏ nhạt, nhẵn với 5 gân gốc nổi rõ. Các gân bên ở phía rìa lá nổi rõ, gân ở giữa lá ở mặt dưới không rõ. Cuống lá dài 0,6 – 1,2 cm, thường nhẵn và có màu trắng xanh, đôi khi hơi đỏ tía ở bẹ lá. Bẹ lá nổi rõ và nhẵn. Số lá trên một cây thay đổi từ 2 – 6, thông thường có 4 lá. Kích thước của lá cũng thay đổi, các lá trên một cây thường có kích thước khác nhau rõ rệt. e. Hoa, quả Hoa lan Kim tuyến dạng cụm, dài 10 – 20 cm ở ngọn thân, mang 4 – 10 hoa mọc thưa. Lá bắc hình trứng, dài 6 – 10 mm, màu hồng. Các mảnh bao hoa dài khoảng 6 mm; cánh môi màu trắng, dài đến 1,5 cm, ở mỗi bên gốc mang 6 – 8 dải hẹp, đầu chẻ đôi. Mùa hoa tháng 10 – 12. Mùa quả chín tháng 12 – 3 năm sau.
  9. 11. Hình 2.1. Cây (A) và hoa (B) lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume 1.1.2. Đặc điểm phân bố 1.1.2.1. Phân bố theo kiểu rừng: Kết quả điều tra đã chỉ ra rằng, hiện nay lan Kim tuyến hầu hết phân bố ở kiểu rừng kín lá rộng thường xanh á nhiệt đới núi thấp, cấu trúc rừng thường có 2 tầng cây gỗ. Đôi khi có thể gặp lan Kim tuyến ở kiểu rừng kín lá rộng thường xanh mưa mùa nhiệt đới. – Tầng ưu thế sinh thái A2: Độ tán che thường từ 85-90%, với các loài cây gỗ chủ yếu như: Chắp tay bắc bộ (ExbuckLandia tonkinensis), Chắp tay (ExbuckLandia populnea), Thích các loại (Acer spp.), Trương vân (Toona surenii), Gội nếp (Aglaia spectabilis), Trám trắng (Canarium album), Kháo thơm (Machilus odoratissima), Sồi phảng (Lithocarpus cerebrinus), Dẻ gai bắc bộ (Castanopsis tonkinensis), Trâm trắng (Syzygium chanlos), Côm tầng (Elaeocarpus griffithii), Trâm tía (Syzygium sp.), Vỏ sạn (Osmanthus spp.), Thừng mực mỡ (Wrightia laevis), Máu chó (Knema spp.), v.v. Chiều cao của tầng A2 từ 15-25 m. – Tầng cây gỗ A3: Bao gồm các loài cây của tầng trên còn nhỏ và các loài cây của tầng dưới như: Hoa trứng gà (Magnolia coco), Trứng gà 3 gân (Lindera sp.), Phân mã tuyến nổi (Archidendron chevalieri), Phân mã (Archidendron balansae), Mắc niễng (Eberhardtia tonkinensis), Nanh chuột (Cryptocarya lenticellata), Re hương (Cinnamomum iners), Re bầu (Cinnamomum Thân khí sinh Thân ngầm A B
  10. 12. bejolghota), Mò roi (Litsea balansae), Trà hoa vàng (Camelia spp.), Xoan đào (Prunus arborea), Trọng đũa (Ardisia spp.), v.v. Chiều cao của tầng A3 từ 8- 15m. – Tầng cây bụi B: Gồm các loài thực vật như Mua đất (Melastoma sp.), Ớt sừng lá nhỏ (Kibatalia mycrophylla), Lấu (Psychotria rubra), Ớt rừng (Clausena sp.), Bọt ếch (Glochidion hirsutum), v.v… – Tầng cỏ quyết: Bao gồm chủ yếu các loài Thường sơn (Dichroa febrifuga), Cao cẳng (Ophiopogon spp.), Gừng một lá (Zingiber monophyllum), Giềng tàu (Alpinia chinensis), Sẹ (Alpinia tonkinensis), Mía dò (Costus speciosus), Mía dò bắc bộ (Costus tonkinensis), Râu hùm (Tacca spp.), Cỏ lá tre (Centosteca latifolia), Rớn đen (Adiantum flabellulatum), Hèo (Calamus rhabdocladus), Lòng thuyền (Curculigo gracilis), Móc (Caryota mitis), v.v… – Thực vật ngoại tầng: Bao gồm các loài thuộc chủ yếu các họ Mã Tiền (Loganiaceae), họ Cau (Arecaceae), họ Na (Annonaceae), họ Kim cang (Smilacaceae), họ Củ nâu (Dioscoreaceae), họ Cà phê (Rubiaceae), họ Đậu (Fabaceae), họ Vang (Caesalpiniaceae), họ Trinh nữ (Mimosaceae), họ Ráy (Araceae), họ Thiên lý (Asclepiadaceae), họ Bòng bong (Schizaeaceae). Điển hình như: Dây hoa dẻ (Desmos chinensis), Dây dất na (Desmos spp.), Dây kim cang các loại (Smilax spp.), Củ nâu (Dioscorea cirrhosa), Móc câu đằng (Uncaria sp.), Ráy leo (Pothos scandens), Dây sưa (Dalbergia candenatensis), Dây móng bò (Bauhinia sp.), Bòng bong các loại (Ligodium spp.), Dây thèm bép (Tetrastigma rupestre), v.v… – Mật độ phân bố: Của Lan Kim tuyến ở đây là rất thấp, trung bình khoảng 20 cây/ha. Chúng phân bố rải rác ở một số điểm thuộc khu vực nghiên cứu. 1.1.2.2. Phân bố lan Kim tuyến theo trạng thái rừng và sinh cảnh – Theo trạng thái rừng: Kết quả điều tra đã khẳng định, lan Kim tuyến phân bố tập trung chủ yếu ở trạng thái rừng IIIA2, thuộc vùng lõi của Vườn quốc gia. Độ tán che của trạng thái rừng này từ 85-90%. Đặc điểm của cây bụi và thảm tươi ở khu vực Lan Kim tuyến phân bố là thưa thớt, độ che phủ thấp thường vào khoảng từ 15-30%, với độ cao của lớp cây bụi và thảm tươi khoảng từ 0,1-0,5m tuỳ từng khu vực. Lan Kim tuyến thường ít phân bố ở những nơi cây bụi thảm tươi dày đặc. Chúng có thể nằm ngay trên lớp thảm mục của rừng đang bị phân huỷ.
  11. 13. – Về sinh cảnh: Lan Kim tuyến chủ yếu phân bố trên đất, chúng mọc sát ngay bề mặt đất, nơi đất giàu mùn, độ ẩm và độ xốp cao, thoáng khí; thậm chí ngay trên lớp thảm mục của rừng đang phân huỷ. Đôi khi chúng mọc trên các tảng đá ẩm, trên các đoạn thân cây gỗ mục, trong gốc cây. Có thể bắt gặp lan Kim tuyến ở trong rừng nơi ẩm ướt, ven các khe suối, dưới tán rừng cây gỗ lớn, hoặc dưới rừng trúc, rừng sặt, trên đường mòn đi lại trong rừng. 1.1.2.3. Phân bố lan Kim tuyến theo địa lý, địa hình và đai cao – Về địa lý, địa hình: Có thể gặp chúng ở hầu hết các dạng địa hình, như chân núi, sườn núi, đỉnh núi. – Về đai cao: Lan Kim tuyến thường phân bố ở đai cao trên 735m, tập trung chủ yếu ở độ cao trên 970m, quanh núi Rùng Rình. 1.2. Nhân giống cây lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus) 1.2.1. Nhân giống bằng hạt Nhân giống bằng hạt hay con gọi là nhân giống hữu tính, trong thiên nhiên sự thụ phấn của lan do côn trùng thực hiện, cấu trúc hoa hoàn toàn thích ứng với sự thụ phấn đó. Hoa lan là một loại hoa lưỡng tính, nhưng do cấu trúc của hoa và sự chín của các cơ quan sinh dục trong hoa không đều nên sự giao phấn nhờ sâu bọ có tính bắt buộc đối với tất cả các loài setaceus. Sự thụ phấn của hoa trong môi trường tự nhiên được côn trùng thực hiện trên cơ sở của mùi thơm, mật, màu sắc sặc sỡ và những cấu tạo của hoa là những nhân tố chính để thu hút các tác nhân thụ phấn từ khoảng cách xa. Ở vườn nuôi trồng lan để đảm bảo kết quả của sự giao phấn cao và tạo ra các giống lai theo ý muốn, con người phải tiến hành thụ phấn nhân tạo. Sự thụ phấn có thể cùng cây, có thể khác cây. Phương pháp này có nhiều ưu điểm: Dễ làm, giá thành hạ, thu được nhiều cây khoẻ, không bị bệnh, ngoài ra do đặc điểm giao phấn chéo có thể thu được những dòng biến dị cho vật liệu chọn tạo giống. Tuy nhiên trong thực tế hạt Lan Kim tuyến rất hiếm, số lượng hạt rất nhiều nhưng tỉ lệ nảy mầm ít, hơn nữa thời gian khá lâu để cây ra hoa có chất lượng tốt. 1.2.2. Nhân giống bằng cây con Khi rễ cây con tương đối nhiều, cây có từ 3-5 lá, cây cứng cáp có thể tách để trồng riêng. Đây là cách nhân giống đơn giản và dễ làm nhất.
  12. 14. 1.2.3. Phương pháp giâm cây Lấy một giả hành cắt ra làm nhiều đoạn, mỗi đoạn có nhiều mấu. Đặt các đoạn này vào một nơi ẩm; chỉ cần cát và rêu. Sau vài tuần sẽ xuất hiện những cây con có thể đem trồng vào các chậu mới. Phương pháp này là phương pháp cổ điển, dễ làm, quen với tập quán, kinh nghiệm của người lao động, giá thành thấp. Tuy nhiên phương pháp này cũng có một số trở ngại như: chậm (tăng khoảng 2-4 cây/năm), chất lượng giống không cao, cây hoa trồng lâu bị thoái hoá, bệnh virus có nhiều khả năng lan truyền và phát triển, từ đó làm giảm phẩm chất hoa (Nguyễn Xuân Linh, 1998)[5a]. 1.2.4. Nhân giống in vitro Nhân giống in vitro là một trong 4 lĩnh vực ứng dụng chính của công nghệ tế bào thực vật và đã mang lại hiệu quả kinh tế lớn nhất (Lê Trần Bình, 1997) Kỹ thuật nhân nhanh in vitro nhằm phục vụ các mục đích sau: Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm và làm vật liệu cho công tác tạo giống. Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các loại cây trồng khác nhau như cây lương thực có củ, các loại cây rau, cây hoa, cây cảnh, cây dược liệu thuộc nhóm thân thảo. Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quý của giống cây lâm nghiệp và gốc ghép trong nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh thuộc nhóm cây thân gỗ. Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng và cách ly tái nhiễm kết hợp với làm sạch virus. Bảo quản các tập đoàn giống nhân vô tính và các loại cây giao phấn trong ngân hàng gen. 1.2.4.1. Cơ sở khoa học của nhân giống in vitro Tính toàn năng của tế bào (totipotency), từ năm 1902 nhà khoa học người Đức HaberLandt đã đề xướng ra phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh cho tính toàn năng của tế bào thực vật. Theo ông, mỗi tế bào được lấy từ bất kỳ cơ quan sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Khả năng này do mỗi tế bào đều chứa bộ gen mang thông tin di truyền của toàn bộ cơ thể, khi được đặt vào môi trường thích hợp tế bào này sẽ có khả năng giống như một hợp tử ban đầu.
  13. 15. Một đặc tính quan trọng khác, làm cơ sở cho nuôi cấy mô tế bào thực vật là khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào. Khả năng biệt hóa là sự biến đổi của tế bào từ tế bào phôi thành toàn bộ các tế bào chức năng trong các cơ quan của cơ thể. Ngược lại, khi được đặt vào môi trường thích hợp, các tế bào chuyên hóa của cơ thể có thể trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên sinh ra nó – tế bào phôi. Tuy nhiên, thực tế nghiên cứu đã chứng minh, khả năng phản biệt hóa của các tế bào là khác nhau, các tế bào chuyên hóa sâu như tế bào của hệ thống mạch dẫn thực vật, tế bào thần kinh động vật, khả năng biệt hóa rất khó xảy ra. Đối với thực vật, khả năng hình thành cơ quan hay cơ thể giảm dần theo chiều từ ngọn xuống gốc (Galson, 1986; Murashige, 1974). Trong tự nhiên, tất cả các loài sinh vật đều tồn tại trong mình tiềm năng sinh sản dù là vô tính hay hữu tính, như thế các loài mới có thể duy trì được kiểu gen của mình, chiến thắng trong quá trình tiến hóa. Nhưng ngay từ khi ra đời, công nghệ nuôi cấy mô đã trở thành công cụ đắc lực phục vụ mục đích nhân giống của con người. Vậy tại sao lại phải tiến hành nhân giống in vitro? Chúng ta hãy xem xét những ý nghĩa to lớn mà nó mang lại cho nhân loại. 1.2.4.2. Ý nghĩa của nhân giống in vitro Nuôi cấy mô tế bào thực vật, thực chất là một phương pháp nhân giống vô tính. Đối với nhiều loại thực vật quý hiếm, có giá trị kinh tế và ý nghĩa sinh học cao, gặp khó khăn trong vấn đề nhân giống hữu tính thì nhân giống vô tính in vitro là công cụ vô cùng hữu ích. Nhưng trên thực tế có nhiều loại thực vật nhân giống hữu tính bằng hạt có hệ số nhân cao nhưng vẫn tiến hành nhân giống vô tính in vitro là do: Các phương pháp nhân giống hữu tính bằng hạt mặc dù cho hệ số nhân giống cao, dễ bảo quản và vận chuyển nhưng với một số cây trồng, khi nhân giống bằng hạt sẽ cho các cây con không hoàn toàn giống bố mẹ cả về hình thái và thành phần hóa học (Calson, 1964). Sự không đồng nhất này gây ra khó khăn trong việc đưa cây vào sản xuất theo dây truyền công nghiệp, vì các cây có chất lượng sản phẩm không đồng đều, làm giảm giá trị thương phẩm. Đặc biệt, đối với các cây thuốc thì việc không đồng nhất về chất lượng hay chính là hàm lượng các chất hoạt tính sẽ dẫn đến hậu quả là nguyên liệu không ổn định, không đáp ứng được nhu cầu sản xuất. Ví dụ: đối với các cây lấy tinh dầu, việc nhân giống bằng hạt dẫn tới sự phân ly không đều về hàm lượng các thành phần hoạt chất. Theo Nilov (1936), cây Lavanda khi nhân giống bằng hạt, hàm lượng
  14. 16. tinh dầu ở cây con phân ly từ 0,5 đến 11,3 %, hàm lượng lynalylacetat từ 11 đến 78 %; cây bạc hà nhân giống hữu tính có sự phân ly rất lớn về hàm lượng và thành phần tinh dầu (Bùi Thị Hằng, Popov, 1975; Bogonina, 1969; Murray, 1960)… Để khắc phục những nhược điểm trên, phương pháp nhân giống vô tính được áp dụng đã mang lại nhiều hiệu quả kinh tế và ý nghĩa sinh học lớn. Phương pháp nhân giống vô tính đã khắc phục được nhiều nhược điểm của nhân giống hữu tính, ưu điểm lớn nhất của nhân giống vô tính là các cây con đồng đều về mặt di truyền do duy trì được các tính trạng của cây mẹ (Petrop, 1989), nên có thể áp dụng sản xuất đại trà cho sản phẩm có chất lượng ổn định; rút ngắn thời gian từ khi trồng đến thu hoạch tạo điều kiện cho tăng vụ, tăng sản lượng đối với những cây có thời gian nảy mầm của hạt kéo dài… Mặc dù vậy, phương pháp nhân giống vô tính truyền thống (chiết, giâm, ghép) vẫn còn nhiều nhược điểm như sự lây nhiễm bệnh qua nguyên liệu thường phổ biến và phức tạp, hệ số nhân thấp: cam thảo là 5 – 7 (Shah, Dalal, 1980), bạc hà piperita là 2-3 (Foldeli, Havas, 1979), … hơn nữa, việc sử dụng chính các bộ phận làm thuốc để nhân giống rất lãng phí, tốn kém. Để khắc phục các nhược điểm của phương pháp nhân giống vô tính truyền thống, một phương pháp nhân giống khác đã áp dụng rộng rãi trên thế giới cũng như ở Việt Nam, đó là phương pháp nhân giống in vitro, phương pháp này có nhiều ưu điểm nổi trội như: – Hệ số nhân giống cao, từ một cây trong vòng một năm có thể tạo thành hàng triệu cây. Hệ số nhân giống ở các loại cây khác nhau nằm trong phạm vi 36 đến 1012 / năm, cao hơn bất cứ phương thức nhân giống nào. Ví dụ: từ một củ khoai tây, sau 8 tháng nhân giống người ta thu được 2000 triệu củ đồng nhất di truyền, được trồng trên một vùng rộng 40 ha, có nghĩa là tốc độ nhân giống vô tính lớn hơn 100.000 lần so với sinh sản hữu tính (Senez, 1987). – Tính đồng nhất và ổn định di truyền cao: Các cây con được tạo ra giống hệt với cây bố mẹ ban đầu. Theo lý thuyết từ bất kỳ một cây chọn lọc ưu việt nào đều có thể tạo ra một quần thể với độ đồng đều cao, số lượng không hạn chế. – Nâng cao chất lượng giống do tạo được các giống sạch bệnh, loại bỏ được các nguồn vi khuẩn, virus, nấm bệnh. Trong công tác nhân giống, vấn đề được quan tâm hàng đầu là số lượng và chất lượng giống. Bằng phương pháp
  15. 18. cuối cùng là tái sinh cây hoàn chỉnh nhưng không phải chỉ có một phương thức chung cho tất cả các thực vật. 1.2.4.3. Các phương thức nhân giống vô tính in vitro Quá trình thực hiện nhân giống in vitro tạo ra các dòng vô tính, theo Shull (1912) dòng vô tính là một nhóm cá thể có kiểu gen tương tự nhau, chúng được nhân bằng sinh sản vô tính, các dòng vô tính này sẽ được tạo ra theo các phương thức sau: – Tái sinh cây trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng, phôi, ngọn chồi, chồi nách. – Tái sinh cây gián tiếp thông qua giai đoạn hình thành mô sẹo. * Tái sinh cây trực tiếp từ mẫu nuôi cấy là quá trình phát động những điểm tồn tại sẵn có trong mô nuôi cấy, phân chia và tái sinh thành cây. Các cây con này được phát sinh từ các đỉnh sinh trưởng có bộ nhiễm sắc thể 2n, hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền và duy trì được các tính trạng của cây mẹ (Hu and Xang, 1983). Tái sinh trực tiếp cũng có thể xuất phát từ những tế bào không nằm trên đỉnh sinh trưởng, đó là các đoạn thân, mảnh lá, cuống lá, mảnh hoa… Trong trường hợp này, các tế bào thường phân chia nhưng không hình thành các tế bào mô sẹo mà tạo thành các điểm sinh trưởng cao hơn ở trường hợp nói trên. * Con đường tái sinh gián tiếp, mẫu cấy khi nuôi trong môi trường thích hợp, thường là với auxin, có thể đem lại sự gia tăng thành khối tế bào không tổ chức, đó chính là các tế bào mô sẹo. Trong nuôi cấy, sự tăng sinh này có thể được duy trì nhiều hay ít là không hạn định, chỉ cần mô sẹo được cấy chuyển sang môi trường mới theo chu kỳ. Tuy nhiên, tế bào mô sẹo khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền. Để tránh tình trạng này nên sử dụng các loại mô sẹo vừa mới phát sinh. Nuôi cấy mô sẹo có vai trò vô cùng quan trọng trong công nghệ sinh học thực vật. Tỷ lệ auxin và cytokinin trong môi trường có thể dẫn tới sự phát triển của ngọn, rễ hay phôi soma; từ đó có thể tạo thành cây hoàn chỉnh. Nuôi cấy mô sẹo cũng có thể được sử dụng để mở đầu nuôi cấy tế bào dịch huyền phù, tạo ra hạt nhân tạo. 1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy 1.3.1. Ảnh hưởng của điều kiện khử trùng mẫu cấy Việc khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy là một ấn đề cần thiết, vì mẫu cấy ở trong tự nhiên tiếp xúc với môi trường xung quanh nên mang rất nhiều vi khuẩn, nấm… Nhưng, do mức độ nhiễm của mỗi loại mẫu là khác nhau
  16. 19. và đặc điểm của từng loại mẫu cũng khác nhau nên cần có sự thử nghiệm về khử trùng mẫu cấy nhằm thu được lượng mẫu vô trùng nhiều mà tốn ít nhiên liệu ban đầu. Khả năng tiêu diệt nấm và khuẩn của hóa chất khử trùng phụ thuộc vào nồng độ, thời gian xử lý và mức độ xâm nhập của chúng vào các ngõ ngách trên bề mặt của mô cấy. Thời gian khử trùng là một điều kiện quan trọng, nó phụ thuộc vào từng loại dung dịch khử trùng và đặc điểm của từng loại mẫu cấy. Với hypoclorite, người ta thường khử trùng trong thời gian 15-30 phút, HgCl2 thường có thời gian ít hơn. Thời gian quá lâu, dung dịch khử trùng xâm nhập vào mẫu có thể gây chết mẫu, thời gian quá ngắn sẽ không loại bỏ hết nấm và vi khuẩn nên mẫu dễ bị nhiễm. Sau khi khử trùng, mẫu cây được đặt vào các môi trường nuôi cấy, từ đây giai đoạn nuôi cấy in vitro bắt đầu. Thành phần của môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng quyết định tới nuôi cấy. 1.3. 2. Ảnh hưởng của các thành phần hóa học Trong nuôi cấy in vitro, cả yếu tố hóa học và yếu tố vật lý của cây trong các bình nuôi đều phải được cung cấp đầy đủ. Môi trường dinh dưỡng phải cung cấp tất cả các ion khoáng cần thiết, nguồn chất hữu cơ bổ sung như amino acid và vitamin, nguồn cacbon cố định, và một thành phần cần cho sự sống cũng phải được cung cấp đó là nước. Các nhân tố vật lý như nhiệt độ, pH, môi trường khí, ánh sáng và áp lực thẩm thấu, cũng phải được duy trì trong giới hạn chấp nhận. Hiện nay trên thế giới có rất nhiều môi trường được sử dụng như môi trường Murashige và Skoog (1962), môi trường Gamborg (1968), môi trường Knop (1974), môi trường Anderson, Went, Knudson, Lindemann…Trong đó môi trường MS được đánh giá là phù hợp rộng rãi nhất với nhiều loại cây trồng, bao gồm cả cây hai lá mầm và cây một lá mầm. Thông thường trong một môi trường nuôi cấy phải đảm bảo các thành phần hóa học sau: Các nguyên tố khoáng Tùy theo nồng độ sử dụng, các nguyên tố khoáng được chia vào hai nhóm là nguyên tố đa lượng và nguyên tố vi lượng. * Nguyên tố đa lượng: Các nguyên tố này thường chiếm 0,1 % khối lượng khô của thực vật. Nitơ, phốt pho, kali, magiê, canxi, và lưu huỳnh là các muối
  17. 20. vô cơ. Chúng có mặt trong các hợp chất quan trọng (diệp lục. protein, acid nucleic, acid amin…), tham gia vào các quá trình như điều chỉnh áp suất thẩm thấu tế bào, vận chuyển năng lượng trong hô hấp, quang hợp, thực hiện vai trò tín hiệu tế bào,… * Nguyên tố vi lượng: Được cung cấp với lượng rất thấp cho thực vật sinh trưởng, phát triển và có nhiều vai trò khác nhau. Mangan, iốt, đồng, coban, bo, mo, sắt và kẽm là các nguyên tố vi lượng, ngoài ra niken và nhôm cũng được tìm thấy trong một số công thức. Nguyên tố vi lượng thường có mặt trong thành phần của một số coenzyme, vitamin; tham gia vào các phản ứng trao đổi điện tử, sinh tổng hợp diệp lục,… Chất hữu cơ bổ sung * Các vitamin là những chất hữu cơ tham gia vào cấu trúc enzyme và cofactor trong nhiều phản ứng sinh hóa (Vũ Văn Vụ, 2006). Các loại vitamin B1, B6, PP và myoinositol là cần thiết cho nuôi cấy tế bào thực vật in vitro. Tuy nhiên, vì lý do lịch sử các loại vitamin khác nhau cũng được thêm vào để nuôi cấy. * Các amino acid có vai trò quan trọng trong việc phát sinh hình thái, amino acid, aLanine, glutamic acid, glutamine và proline cũng được sử dụng nhưng trong nhiều trường hợp là không cần thiết. Nguồn cacbon Các mô và tế bào thực vật nuôi cấy nói chung, không thể tự quang hợp hoặc quang hợp yếu do thiếu clorophin và các điều kiện khác…do đó phải bổ sung thêm cacbon. Saccharose thường được sử dụng làm nguồn cacbon do đó những đặc tính như rẻ, dễ kiếm, đồng hóa triệt để và tương đối ổn định. Ngoài ra, các loại đường khác như glucose, maltose, galactose và sorbitol cũng có thể được sử dụng và trong những trường hợp đặc biệt có thể cung cấp tốt hơn đường saccharose. Đường vừa là nguồn cacbon cung cấp cho mẫu nuôi cấy, đồng thời còn tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu của môi trường. Đường đóng góp khoảng 50-70 % vào khả năng thẩm thấu của môi trường (Trigiano and Gray, 2000). Thông thường đường saccharose được sử dụng ở nồng độ 0,2-0,3 %, nhưng nồng độ này có sự thay đổi ở từng đối tượng khác nhau và mục đích nuôi cấy khác nhau, có khi xuống tới 0,2 % (tạo dòng), có khi tăng lên đến 12 % (gây cảm ứng stress nước).
  18. 21. Sự hình thành rễ đòi hỏi một lượng đường được cung cấp từ quang hợp hoặc ngoại sinh. Theo George (1993) hầu hết các loại thực vật khi ra rễ thích hợp với lượng đường 20-30 g/lít. Tuy nhiên, cũng có loài yêu cầu nguồn carbohydrate ngoại sinh cao hơn. Ví dụ theo Sharma (1993) cây Gentiana kurroo chỉ có thể ra rễ tốt khi bổ sung 60 g/lít saccharose trong môi trường. Thí nghiệm áp dụng phương pháp quang tự dưỡng cho thấy các cây in vitro đã phát triển tốt trên môi trường không có đường và vitamin, độ thoáng khí cao. Tỷ lệ nhiễm nấm giảm đáng kể. Cây có diện tích lá lớn hơn và sự đóng mở của lá theo quy luật tự nhiên ngay khi gặp điều kiện thay đổi của môi trường. Trong khi đó cây nuôi cấy theo điều kiện truyền thống (có đường và vitamin) có diện tích lá nhỏ, khí khổng luôn luôn ở trạng thái mở trong nhiều giờ khi chuyển từ điều kiện in vitro ra vườn ươm. Tỷ lệ sống 95-100 % sau một tháng ở vườn ươm đối với cây nuôi cấy trên môi trường không có đường, trái lại chỉ từ 70-80 % theo phương pháp truyền thống (Nguyễn Thị Quỳnh và cộng sự, 2005). Chất điều tiết sinh trưởng Chất điều tiết sinh trưởng thực vật là thành phần môi trường khắt khe trong việc xác định con đường phát triển của tế bào thực vật. Các chất điều tiết sinh trưởng được sử dụng thông thường là các hormome thực vật hoặc các chất tổng hợp tương tự chúng, phổ biến là auxin và cytokinin, gibberellins, abscisic acid, ethylene. Trong đó auxin và cytokinin là hai nhóm được sử dụng phổ biến nhất. * Nhóm auxin gồm một số hợp chất có chứa nhân idol trong phân tử. Trong nuôi cấy in vitro, auxin thúc đẩy sinh trưởng của mẫu do hoạt hóa sự phân chia và giãn nở của tế bào, kích thích các quá trình tổng hợp và trao đổi chất, tham gia điều chỉnh sự phân hóa của rễ, chồi…(Bhojwani and Razdan, 1983). Các auxin được sử dụng với nồng độ thấp từ 10-6 – 10-1 M tùy theo từng chất, mục đích và đối tượng nghiên cứu. Hàm lượng auxin thấp sẽ kích thích sự phân hóa rễ, hàm lượng cao kích thích hình thành mô sẹo. Auxin được chia thành hai nhóm có nguồn gốc khác nhau: trong các auxin tự nhiên, quan trọng nhất là IAA. Nhưng IAA chỉ được dùng trong một số môi trường nuôi cấy do có đặc tính không ổn định với nhiệt độ và ánh sáng. Vì vậy, các amino acid kết hợp với IAA ổn định hơn được sử dụng phổ biến hơn làm
  19. 22. giảm bớt liên kết khi sử dụng IAA. Nhóm auxin tổng hợp tương tự IAA được sử dụng rộng rãi hơn trong các môi trường nuôi cấy như 2,4-D, IBA. NAA. * Cytokinin kích thích sự phân chia và ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của tế bào, cảm ứng hình thành chồi phụ và loại bỏ ưu thế ngọn (Nguyễn Như Khanh, 2002). Trong nuôi cấy mô thực vật cytokinin được dùng để kích thích sự phát sinh chồi, sử dụng kết hợp với auxin kích thích phân chia tế bào. Nồng độ cytokinin cao kìm hãm sự hình thành và phát triển của rễ (Narayaswamy, 1994). Trong các cytokinin tự nhiên có hai nhóm được sử dụng trong môi trường nuôi cấy, đó là zeatin và 2iP (2-isopentyl adenine). Nhưng chúng không được dùng phổ biến vì rất đắt (đặc biệt là zeatin) và không ổn định. Các chất tổng hợp tương tự như kinetin và BAP được sử dụng phổ biến hơn. Các chất hóa học không có based purin và thay thế bằng phenylureas, cũng được sử dụng như cytokinin trong môi trường nuôi cấy tế bào thực vật. Trong cây có sự cân bằng nội hoocmone (Vũ Văn Vụ, 2007). Do vậy, khi sử dụng các chất điều tiết sinh trưởng trong nuôi cấy cần đặc biệt lưu ý để sử dụng nồng độ thích hợp đạt hiệu quả cao. Nhiều tác giả đã tổng kết, tỷ lệ auxin/cytokinin nếu nghiêng về phía auxin sẽ kích thích hình thành rễ; nghiêng về phía cytokinin sẽ thúc đẩy hình thành chồi; ở tỷ lệ trung gian sẽ hình thành mô sẹo. Than hoạt tính Than hoạt tính ban đẫu được bỏ sung vào môi trường nuôi cấy để cố gắng mô phỏng điều kiện trồng trọt, sau đó nó được sử dụng rộng rãi trong nhiều môi trường nuôi cấy. Nhiều nghiên cứu cho thấy tác dụng của than hoạt tính trong môi trường nuôi cấy mô thực vật. Đó là: sự hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol, các sản phẩm trao đổi thứ cấp, ảnh hưởng tới pH, xúc tác bẻ gãy đường saccharose trong khử trùng (S.C. Van Winkle et al, 1995). Ngoài ra than cũng hút các chất hữu cơ như phytohormone, vitamin, sắt, kẽm, … (Nissen & Sutter, 1990). Điều tra tác dụng của than hoạt tính, sự khử trùng, và môi trường nuôi cấy trong thủy phân đường cho thấy, sự thủy phân của đường trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào cả ion H+ và sự khử trùng và thành phần than hoạt tính. Sau khử trùng, ở môi trường MS + 5 % saccharose bổ sung than hoạt tính cho tỷ lệ đường thủy phân là 70 %, tỷ lệ tương ứng ở môi trường Gamborg là 56 %, còn ở môi trường không có than hoạt tính là 20 % (Pan and Staden, 1999).
  20. 24. phòng nuôi cấy người ta sử dụng ánh sáng huỳnh quang chiếu sáng 14-15 giờ/ ngày với cường độ 2000 lux. Nhiệt độ Nhiệt độ trong phòng nuôi cấy mô thường được điều chỉnh ổn định từ 220 C đến 250 C. Tuy nhiên tùy từng loại nuôi cấy và đối tượng nuôi cấy mà có sự điều chỉnh nhiệt độ phù hợp. Theo nhiều nghiên cứu trong nuôi cấy mô sẹo, huyền phù tế bào với mục đích sản xuất các hợp chất thứ sinh thì sự điều chỉnh nhiệt độ rất có ý nghĩa, cảm ứng cho tế bào sinh trưởng, phân chia và tiết các hợp chất thứ sinh. Nhiệt độ còn ảnh hưởng tới nuôi cấy thông qua tác đông tới cấu trúc của các chất điều hòa sinh trưởng như IAA, GA3,… pH môi trường pH của môi trường cũng là một yếu tố rất quan trọng, ảnh hưởng tới trạng thái lý hóa của các chất trong môi trường, do đó ảnh hưởng tới khả năng điện ly của các muối, sự thủy phân hóa các chất… Thông thường pH được điều chỉnh ở mức 5,5 – 5,8. Trạng thái môi trường Sự phát triển của mô có thể bị thay đổi hoàn toàn nếu chúng nuôi cấy trên một môi trường đặc, lỏng hoặc nửa lỏng. Các mô nuôi cấy thường sinh trưởng tốt hơn trong môi trường lỏng, tuy nhiên môi trường lỏng cũng gây ra hiện tượng thủy tinh hóa, các mô nuôi cấy bị mọng nước gây khó khăn cho cấy chuyển và ra cây. 1.3.4. Ảnh hưởng của điều kiện ra cây Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình sản xuất một cây giống in vitro. Mục đích của giai đoạn này nhằm đưa cây giống in vitro trong phòng nuôi ra ngoài tự nhiên; huấn luyện cây thích nghi với các điều kiện nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng tự nhiên và chuyển từ chế độ dị dưỡng sang chế độ tự dưỡng. Mỗi loài cây có đặc điểm khác nhau, do đó để đạt tỷ lệ cây sống cao cần nghiên cứu để tìm giá thể phù hợp cho cây. Giá thể trồng cây có thể là cát, đất mùn hoặc các hỗn hợp nhân tạo không chứa đất, mùn cưa và bọt biển… Cây nuôi cấy in vitro có đặc điểm là các khí khổng luôn mở. Vì vậy, khi chuyển cây ra vườn ươm, cây thường bị mất nước rất nhanh, do đó cần phải che phủ cẩn thận và cung cấp đủ độ ẩm cho cây bằng cách phun sương. Cần cung
  21. 25. cấp cho cây lượng nước vừa đủ, lượng nước quá ít hoặc quá nhiều đều có ảnh hưởng không tốt cho cây. Ngoài ra, ở giai đoạn đầu đưa ra ngoài vườn ươm, bộ rễ của cây nuôi cấy in vitro thường chưa có khả năng hấp thụ các chất ding dưỡng từ giá thể. Để tăng chất lượng của cây giống, có thể sử dụng các dung dịch dinh dưỡng để tưới cho cây. 1.4. Quy trình sản xuất cây cấy mô Theo Debergh (1991) thì quy trình nhân giống được chia làm 5 giai đoạn: a) Lấy mẫu và xử lý mẫu Đây là giai đoạn đầu tiên trong quy trình, cần đặc biệt chú ý vì những đặc tính của mẫu cấy sẽ được duy trì và nhân lên ở tất cả các cây giống sau này. Cần chọn lọc cây mẹ ưu việt, khỏe, có giá trị kinh tế cao; trên cây mẹ tiến hành chọn cơ quan, mô để lấy mẫu, thường là chồi non, đoạn thân có chồi ngủ, hoa non, lá non… Khả năng nhiễm bệnh của mẫu phụ thuộc vào cách lấy mẫu, xử lý mẫu và điều kiện khử trùng. Mỗi loài cây có ngưỡng nhiệt độ và độ ẩm phù hợp khi bảo quản và xử lý mẫu. Với các cây cận nhiệt đới và nhiệt đới thì nhiệt độ 250 C, độ ẩm 75 % là điều kiện giữ mẫu thích hợp, tỷ lệ nhiễm bệnh thấp (Deborgh and Zimmerman, 1991). b) Tái sinh mẫu nuôi cấy Mục đích của giai đoạn này là tái sinh các cơ quan từ mẫu nuôi cấy. Khả năng thành công của nuôi cấy mô tế bào thực vật phụ thuộc vào trạng thái tuổi của tế bào mẫu nuôi cấy, càng gần trạng thái phôi sinh thì khả năng tái sinh càng lớn. Sau một thời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào hoặc cơ quan (chồi, cụm chồi, rễ) hoặc các phôi vô tính có đặc tính gần như phôi hữu tính. c) Nhân nhanh chồi Cần tạo ra tốc độ nhân nhanh cao nhất trong điều kiện nuôi cấy, vì vậy thành phần và điều kiện môi trường phải được tối ưu nhằm đạt được mục tiêu nhân nhanh. Môi trường ở giai đoạn này cần bổ sung các hormone sinh trưởng (cytokinin, auxin), tăng thời gian chiếu sáng lên từ 16 giờ/ ngày, cường độ ánh sáng tối thiểu là 1000 lux, nhiệt độ thích hợp là từ 20 – 300 C. Quy trình cấy chuyển nhân nhanh chồi thông thường diễn ra trong khoảng
  22. 26. 1-2 tháng tùy từng loại cây. Tỷ lệ nhân nhanh sau mỗi lần cấy chuyển đạt khoảng 2 – 8 lần/ 1 lần cấy chuyển. Giai đoạn nhân nhanh chồi từ một vài chồi ban đầu không nên kéo dài quá lâu để tránh biến dị soma. Ví dụ từ một chồi cây chuối chọn lọc ban đầu người ta chỉ nên nhân lên khoảng 2000 – 3000 chồi cây sau 7 – 8 lần cấy chuyển, đối với các cây khác như mía, cúc, hoa phong Lan sau một năm có thể nhân được trên 1 triệu chồi từ một cây mẹ ban đầu. d) Tái sinh rễ Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát rễ tự sinh, nhưng thông thường các chồi này phải được cấy chuyển sang một môi trường khác để kích thích tạo rễ. Môi trường tái sinh rễ thường được bổ sung auxin (NAA, IBA, 2,4-D) ở liều lượng thích hợp. Tuy nhiên, một số cây như chuối thì sự hình thành rễ tốt hơn ở môi trường không có chất sinh trưởng. e) Chuyển cây ra vườn ươm Các cây nuôi cấy in vitro sau khi đã tái sinh hoàn chỉnh sẽ được chuyển ra ngoài vườn ươm. Cây chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng. Vì vậy, cần huấn luyện cho cây thích nghi với sự thay đổi của môi trường. 1.5. Tình hình nghiên cứu cây lan Kim tuyến 1.5.1.Tình hình nghiên cứu trên thế giới Chi lan Kim tuyến (Anoectochilus) đã được nghiên cứu chủ yếu ở Trung Quốc một cách toàn diện cả về đặc điểm hình thái, kỹ thuật nhân giống, khả năng trồng, thành phần hóa học và công dụng phòng, chữa bệnh (Lai Wan Yu, Lai Wan Nian, 2005). Chow và CS (1982) đã nghiên cứu về nguồn vật liệu sử dụng cho nhân sinh khối in vitro loài Anoectochilus formosanus rất đa dạng. Năm 1987, Liu và CS đã chọn chồi đỉnh để nuôi cấy mô. Cũng năm 1987, Ho và CS, năm 1992, Lee và CS đã sử dụng phôi hạt để làm nguồn vật liệu nuôi cấy. Năm 2001, các tác giả Yih-juh Shiau, Abhay Psagare, Uei-Chin Chen, Shu-Ru Yang và Hsin-Sheng Tsay đã nghiên cứu thành công loài Lan Kim tuyến (Anoectochilus formosanus Hayata) từ hạt với công thức môi trường vào mẫu là: 1/2MS + 0,2% than hoạt tính + 8% dịch chiết chuối. Môi trường được sử dụng để nhân nhanh chồi là: 1/2MS + 0,2% than hoạt tính + 8% dịch chiết chuối + 2mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA.
  23. 27. Năm 2002, Tsay và CS đã cắt các mắt đốt thân lấy từ cây Anoectochilus Formosanus Hayata 2 năm tuổi cấy vào môi trường MS lỏng dung tích 500 ml + 2mg/l BAP + 0,5mg/l NAA + 2% than hoạt tính. 1.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước Hiện nay, lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) được xếp trong nhóm IA trong sách đỏ Việt Nam, cần bảo tồn các quần thể nhỏ còn sót lại ở các Vườn Quốc gia và Khu Bảo tồn thiên nhiên, cũng như cần nghiên cứu nhân giống tạo hàng hóa xuất khẩu và bảo vệ nguồn gen. Ở Việt Nam do bị người dân thu hái tự phát để bán làm thuốc nên loài lan Kim tuyến đang bị đe dọa nghiêm trọng, rất có thể sẽ bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên nếu chúng ta không có biện pháp bảo tồn hữu hiệu. Mặc dù vậy cho đến nay, ở nước ta vẫn chưa có bất kì công trình nghiên cứu nào về kỹ thuật nhân giống, gây trồng cho loài cây quý này được công bố. Do vậy, có thể nói việc nghiên cứu nhân nhanh loài lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume bằng phương pháp nhân giống in vitro vừa có ý nghĩa lý luận và ý nghĩa về mặt thực tiễn. Những năm gần đây, đã có một số đề tài nghiên cứu về đặc điểm hình thái, phân bố và kỹ thuật nhân giống in vitro loài lan Kim tuyến này như: Năm 2004, Nguyễn Văn Kiệt cũng đã đưa ra quy trình nhân giống in vitro thành công cho loài lan Kim tuyến Anoectochilus formosanus với vật liệu ban đầu là từ chồi đỉnh tại đại học Chungbuk, Hàn Quốc. Môi trường tạo vật liệu khởi đầu là H3 (Hyponex: 6,5N-4,5P-19K 1g/l + 20N-20P-20K 1g/l) + 2g/l peptone. Môi trường nhân nhanh là: H3 + 1mg/l BAP (hoặc 1-2mg/l TDZ) + 1% than hoạt tính. Năm 2010, Phùng Văn Phê, Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nguyễn Trung Thành. Đã đạt được những kết quả bước đầu trong nhân nhanh chồi in vitro loài Lan kim tuyến – Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl. Nă m 2010,Phan Ngọc Khoa, Trường Đại học Khoa học Huế đã nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến nhân giống in vitro lan Kim tuyến.”. Các tác giả trên đã bước đầu tiến hành thăm dò ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng và bước đầu tiến hành nhân giống thử nghiệm lan Kim tuyến nhưng chưa tác giả nào đưa ra quy trình hoàn chỉnh để nhân giống loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume). Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi đặc biệt chú trọng đến nghiên cứu nhân nhanh và quy trình ra cây hoàn chỉnh cho loài thảo dược quý hiếm này.
  24. 28. CHƯƠNG II. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Cây lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) Hình 2.1. Cây Lan Kim tuyến ngoài tự nhiên Mẫu chồi được tái sinh từ thân ngầm, thân khí sinh của cây lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) được thu từ Vườn quốc gia Tam Đảo, Vĩnh Phúc. 2.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu + Địa điểm: Thí nghiệm được tiến hành tại Viện Sinh học Nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội và Phòng công nghệ tế bào Thực vật, Trung tâm Nghiên cứu Khoa học Sự sống, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên. + Thời gian: từ tháng 11/2011 – 12/2012 2.2. Mục tiêu nghiên cứu – Xác định điều kiện khử trùng mẫu nuôi cấy thích hợp, tìm ra các môi trường thích hợp cho việc nhân nhanh in vitro. – Xác định điều kiện ra cây và bước đầu đưa cây ra vườn ươm.
  25. 29. 2.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2.3.1. Ý nghĩa khoa học – Đề tài sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học về loài lan (Anoectochilus setaceus Blume), chi Lan Kim tuyến. – Cung cấp những cơ sở khoa học về quy trình nhân giống in vitro lan Anoectochilus setaceus Blume. – Các kết quả nghiên cứu sẽ bổ sung thêm tài liệu khoa học phục vụ cho công tác giảng dạy, nghiên cứu khoa học về loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume). 2.3.2. Ý nghĩa thực tiễn – Đề xuất được quy trình nhân giống in vitro cho lan Anoectochilus setaceus Blume. – Góp phần bảo tồn, thúc đẩy sản xuất cây Anoectochilus setaceu Blume như một nghề trồng lan mang lại giá trị kinh tế cao. 2.4. Nội dung nghiên cứu 2.4.1. Nghiên cứu xác định chất khử trùng, thời gian khử trùng và cơ quan vào mẫu thích hợp. 2.4.2. Nghiên cứu xác định môi trường khởi động và nhân nhanh thích hợp. + Xác định môi trường nền thích hợp. + Nghiên cứu ảnh hưởng của các nhóm chất điều tiết sinh trưởng đến sự phát sinh hình thành và hệ số nhân. 2.4.3. Nghiên cứu môi trường thích hợp cho sự ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh. 2.4.4. Nghiên cứu điều kiện ra cây thích hợp cho loài lan Kim tuyến (Anoectochilus Setaceus Blume). 2.5. Phương pháp nghiên cứu Điều kiện nuôi cấy – Mẫu được cấy trên môi trường đã được khử trùng ở 1,4 atm, 1210 C
  26. 30. – pH của môi trường là: 5,4. – Nhiệt độ phòng nuôi: 25±20 C – Cường độ ánh sáng: 2000 lux – Thời gian chiếu sáng: 16 giờ chiếu sáng/ngày đêm 2.5.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm A. Xác định các phương pháp khử trùng tạo mẫu sạch Thí nghiệm 1. Xác định chất khử trùng thích hợp Chồi và mắt đốt ngang thân cây lan Kim tuyến sau thu hái, được rửa sạch bằng xà phòng, sau đó được thử nghiệm khử trùng bằng cồn 70o và H2O2 0,01% trong các khoảng thời gian khác nhau. Sau đó được rửa sạch lại nhiều lần bằng nước cất vô trùng rồi cấy vào môi trường vào mẫu là: 1/2MS + 0.2% than hoạt tính + 0,8% dịch chiết chuối. Thí nghiệm được tiến hành với các công thức khử trùng: CT1: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s. CT2: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 20s. CT3: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 30s. CT4: Ngâm trong NaClO 2% trong 5 phút (300s). CT5: Ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút (600s). CT6: Ngâm trong NaClO 2% trong 15 phút (900s). CT7: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s rồi ngâm trong NaClO 2% trong 5 phút. CT8: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s rồi ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút. CT9: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s rồi ngâm trong NaClO 2% trong 15 phút. Thí nghiệm 2. Xác định cơ quan vào mẫu thích hợp nhất cho việc tạo mẫu sạch Các cơ quan khác nhau là: Chồi đỉnh, chồi nách, mắt đốt ngang thân được
  27. 31. khử trùng bằng công thức khử trùng hiệu quả nhất (rút ra ở Thí nghiệm 1). Theo dõi số mẫu sống, số mẫu bị nhiễm. Thí nghiệm 3. Xác định cơ quan vào mẫu thích hợp đến hệ số nhân chồi in vitro Cấy mẫu vào môi trường nhân cơ bản là MS + 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin + 100 ml/l ND + 100 g/l dịch chiết khoai tây + 20 g/l sucrose + 7 g/l agar. Mỗi loại vật liệu (chồi đỉnh, chồi nách, mắt đốt ngang thân) được bố trí 3 lần lặp lại, mỗi lần 7 mẫu. B. Xác định môi trường khởi động và nhân nhanh thích hợp Khi các mẫu sạch bệnh được chuyển sang môi trường nhân nhanh. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện nuôi trồng khác nhau đối với quá trình nhân nhanh. Mỗi công thức được bố trí 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 7 mẫu, mỗi công thức là 21 mẫu. Thí nghiệm 4. Xác định môi trường nền thích hợp cho nuôi cấy mô cây Lan Kim tuyến (A. setaceus) Thí nghiệm được tiến hành dựa trên ba môi trường nền được sử dụng phổ biến hiện nay là MS, Knudson C và Knudson C cải tiến (Knud*). Các công thức được tiến hành trên nền môi trường chung là: Nền môi trường = 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar. CT1: Knud* + Nền môi trường CT2: MS + Nền môi trường CT3: Knudson C + Nền môi trường Thí nghiệm 5. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất cytokinin (BAP và kinetin) đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân Sau khi tìm ra môi trường nền thích hợp trong thí nghiệm 4, thí nghiệm 5 tiếp tục tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất cytokinin tới khả năng phát sinh chồi lan Kim tuyến. Trong đó, môi trường nền sử dụng chung cho các
  28. 32. công thức là: Nền môi trường = Môi trường nền (TNo4) + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar. CT1: ĐC CT2: Nền môi trường + 0,1mg/l BAP CT3: Nền môi trường + 0,5mg/l BAP CT4: Nền môi trường + 1,0 mg/l BAP CT5: Nền môi trường + 2,0 mg/l BAP CT6: Nền môi trường + 0,1mg/l Kinetin CT7: Nền môi trường + 0,5mg/l Kinetin CT8: Nền môi trường + 1,0 mg/l Kinetin CT9: Nền môi trường + 2,0 mg/l Kinetin Thí nghiệm 6. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất Auxin (IBA và α-NAA) đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân Thí nghiệm tiếp tục được tiến hành trên nền môi trường trên và thăm dò ảnh hưởng của auxin với các nồng độ khác nhau Nền môi trường = Môi trường nền (TNo4) + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar. CT1: ĐC CT2: Nền môi trường +0,5 mg/l IBA CT3: Nền môi trường +1,0 mg/l IBA CT4: Nền môi trường +1,5 mg/l IBA CT5: Nền môi trường +2,0 mg/l IBA CT6: Nền môi trường +3,0 mg/l IBA CT7: Nền môi trường +0,5 mg/l α-NAA CT8: Nền môi trường +1,0 mg/l α-NAA CT9: Nền môi trường +1,5 mg/l α-NAA CT10: Nền môi trường +2,0 mg/l α-NAA
  29. 33. CT11: Nền môi trường +3,0 mg/l α-NAA Thí nghiệm 7. Nghiên cứu ảnh hưởng của sự phối hợp 2 nhóm chất là cytokinin và auxin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân Qua các kết quả thực nghiệm cho thấy, nồng độ BAP và Kinetin khi sử dụng phối hợp là 0,5mg/l và 0,3mg/l do đó thí nghiệm sẽ tiếp tục thăm dò ảnh hưởng của sự phối hợp 2 nhóm chất trên dựa trên nền môi trường: Nền môi trường = Môi trường nền (TNo4) + 0,5mg/l BAP + 0,3mg/l Kinetin + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar. CT1: Nền môi trường +0,1mg/l IBA CT2: Nền môi trường +0,3mg/l IBA CT3: Nền môi trường +0,5mg/l IBA CT4: Nền môi trường + 0,1mg/l α-NAA CT 5: Nền môi trường +0,3mg/l α-NAA CT6: Nền môi trường +0,5mg/l α-NAA C. Nghiên cứu ra rễ tạo cây hoàn chỉnh Khi các chồi lan Kim tuyến có chiều cao 3-4 cm, có 3-4 lá được cấy chuyển sang môi trường ra rễ. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền (không có chất điều tiết sinh trưởng) và than hoạt tính đến sự ra rễ. Mỗi công thức được bố trí 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 6 mẫu, mỗi công thức là 18 mẫu. Thí nghiệm 8. Ảnh hưởng của môi trường nền (môi trường dinh dưỡng cơ bản) đến sự ra rễ CT1: MS + 20g/l Sucrose + 7g/l agar CT2: MS/2 + 20g/l Sucrose + 7g/l agar CT3: Knud* + 20g/l Sucrose + 7g/l agar CT4: Knud*/2 + 20g/l Sucrose + 7g/l agar Thí nghiệm 9. Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến sự ra rễ Các thí nghiệm được tiến hàn trên nền môi trường nghèo dinh dưỡng
  30. 34. CT1= ĐC= Nền = MS + 20g/l Sucrose + 0% than hoạt tính + 7g/l agar CT2: Nền + 1% than hoạt tính CT3: Nền + 3% than hoạt tính CT4: Nền + 5% than hoạt tính D. Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện chăm sóc tới khả năng sinh trưởng của loài lan Kim tuyến (Anoectochilus Setaceus Blume) in vitro ngoài vườn ươm. Cây cao 3-4cm, mọc 3-4 lá và có 3-4 rễ đủ tiêu chuẩn đưa ra ngoài vườn ươm. Cây in vitro cho ra khỏi môi trường tạo rễ, rửa sạch agar bám trên rễ, rồi trồng trong giá thể ngoài vườn ươm. * Cách bố trí thí nghiệm: – Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, mỗi công thức lặp lại 3 lần, mỗi chậu trồng 3 cây. – Định kì theo dõi: 7 ngày/1lần, chúng tôi đo chiều cao cây, đến rễ lá, số nhánh trong mỗi lần đo định kì. – Số cây theo dõi – Cách tưới: Phun mù dưới dạng sương mù vào lúc sáng sớm Thí nghiệm 10. Nghiên cứu giá thể phù hợp cho việc ra cây loài Lan Kim tuyến (Anoectochilus Setaceus Blume) in vitro Giá thể: CT 1: Giá thể 100% dớn CT 2: Giá thể 50% Dớn + 50% xơ dừa CT 3: Giá thể 100% xơ dừa CT 4: Giá thể 100% bột dừa Thí nghiệm 11. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian huấn luyện cây trong bình đến tỷ lệ sống của lan Kim tuyến khi trồng lên giá thể Thí nghiệm được bố trí với thời gian huấn luyện cây khác nhau: ĐC: 0 ngày CT1: 4 ngày CT2: 8 Ngày
  31. 35. CT3: 12 Ngày CT4: 16 ngày Cây sau khi huấn luyện sẽ được trồng vào giá thể là dớn và xơ dữa trộn lẫn trong nhà lưới được che kín bằng lưới đen. Thí nghiệm 12. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian che phủ ở nhà lưới đến tỷ lệ sống của lan Kim tuyến khi trồng lên giá thể Cây Lan in vitro sau khi huấn luyện, đủ tiêu chuẩn đem ra trồng, sẽ được rửa sạch thạch và trồng lên giá thể ở nhà lưới. Luống cây sau khi trồng sẽ được che kín bằng nilon trắng, phía trên che bằng lưới đen có độ che sáng 50%. Thí nghiệm được bố trí với các khoảng thời gian che kín nilon khác nhau: ĐC: 0 ngày CT1: 5 ngày CT2: 10 Ngày CT3: 15 Ngày 2.5.2. Phương pháp đánh giá kết quả và xử lý số liệu Các chỉ tiêu theo dõi Σ Số mẫu nhiễm 1. Tỷ lệ nhiễm (%) = x 100 Σ Số mẫu theo dõi Σ Số mẫu sống 2. Tỷ lệ mẫu sống ( %) = x 100 Σ Số mẫu theo dõi Σ Số mẫu tạo chồi 3. Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) = x 100 Σ Số mẫu cấy ban đầu
  32. 36. Σ Số mẫu thu được 4. Hệ số nhân (lần) = Σ Số mẫu cấy ban đầu Σ Chiều cao các chồi 5. Chiều cao TB chồi (cm) = Σ Chồi theo dõi Σ Số chồi thu được 6. Số chồi (chồi/mẫu) = Σ Số mẫu ban đầu Σ Số đốt 7. Số đốt (đốt/chồi) = Σ Số chồi Σ Số lá 8. Số lá (lá/chồi) = Σ Số chồi Σ Số mẫu tạo rễ 9. Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%) = x 100 Σ Số mẫu theo dõi Σ Số rễ 10. Số rễ (rễ/chồi) = Σ Số chồi
  33. 37. Σ Chiều dài rễ 11. Chiều dài TB rễ (cm) = Σ Số rễ Phương pháp xử lý số liệu Số liệu được xử lý theo chương trình MICROSOFT EXCEL và IRRISTART 5.0 trên máy vi tính. 12. Chỉ tiêu thu thập: Tỷ lệ sống của cây con, đặc điểm của cây con Số cây sống Tỷ lệ sống của cây con = x 100 Tổng số cây trồng ban đầu Đặc điểm của cây con (màu sắc lá, hình thái lá và rễ). 13. Thời gian thu thập: cứ 1 tuần quan sát và ghi số liệu 1 lần.
  34. 38. CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu sạch và xác định cơ quan vào mẫu phù hợp cho việc nhân nhanh in vitro Nhân giống in vitro có hệ số nhân giống cao, cây con tạo ra đồng nhất và sạch bệnh. Muốn vậy, trong bất kỳ quy trình nhân giống nào thì việc chọn vật liệu khởi đầu và việc tạo mẫu sạch in vitro chính là điều kiện tiên quyết để quyết định thành công của toàn bộ quá trình. Bởi vì đây chính là giai đoạn cung cấp nguồn mẫu sạch cho các giai đoạn tiếp theo của quá trình nhân giống. Mẫu sạch in vitro được tạo ra từ nhiều nguồn, có thể là từ các bộ phận sinh dưỡng (thân, lá, rễ, phát hoa…) hoặc từ cơ quan sinh sản (quả). Trong nghiên cứu này các loại vật liệu đã sử dụng là thân khí sinh, thân ngầm được cắt đoạn và cho vào mẫu để lựa chọn loại mẫu cấy phù hợp. 3.1.1. Xác định chất khử trùng thích hợp Khử trùng mẫu là khâu quan trọng nhằm loại bỏ các nguồn nấm, vi khuẩn, virus khỏi mẫu, thu được nguồn mẫu vô trùng cho các nghiên cứu tiếp theo. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới kết quả khử trùng như phương pháp lấy mẫu, thời điểm lấy mẫu, thời gian khử trùng, hóa chất khử trùng… Trong thí nghiệm này hóa chất được sử dụng là cồn 70⁰ và NaClO 2% bố trí ở các khoảng thời gian khác nhau. Sau khi khử trùng mẫu được cấy vào môi trường vào mẫu, sau một khoảng thời gian nhất định, thường là từ sau 2-3 tuần những mẫu sạch bắt đầu tái sinh. Đánh giá khả năng tái sinh là bước tiếp theo để tìm ra công thức khử trùng tốt nhất. Kết quả thu được sau 15 ngày thể hiện ở Bảng 3.1.
  35. 39. Bảng 3.1. Ảnh hưở hiệu quả tạo mẫu sạch Công thức thí nghiệm Chất khử trùng CT1 Cồn 70⁰ (A)CT2 CT3 CT4 NaClO 2%CT5 CT6 CT7 Cồn 70⁰ (A) + NaClO 2% CT8 CT9 Hình 1. Ảnh hưởng của ch tạo mẫu sạch cây Qua bảng 3.1 và đồ th Với chất khử trùng là c 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00 90.00 100.00 CT1 CT2 CT3 ởng của chất khử trùng và thời gian khử ch cây lan Kim tuyến (kết quả theo dõi sau 15 ngày) trùng Thời gian khử trùng (s) Tỷ lệ mẫu sống (%) (A) 10 47,62 20 28,57 30 14,29 NaClO 2% (B) 300 42,86 600 57,14 900 33,33 (A) + NaClO 2% (B) 10A + 300B 71,43 10A + 600B 90,48 10A + 900B 61,90 a chất khử trùng và thời gian khử trùng đ ch cây lan Kim tuyến (kết quả theo dõi sau 15 ngày) thị 3.1 ta có nhận xét sau: trùng là cồn 70⁰ : CT4 CT5 CT6 CT7 CT8 CT9 Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) ử trùng đến theo dõi sau 15 ngày) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) 52,38 47,62 38,10 23,81 9,52 19,05 38,01 28,57 33,33 trùng đến hiệu quả theo dõi sau 15 ngày) Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)
  36. 40. Cồn 700 là chất có tác dụng sát khuẩn và phá hủy thành cellulozo của tế bào thực vật nên khi kéo dài thời gian khử trùng thì tỷ lệ sống của mẫu giảm đồng thời tỷ lệ nhiễm cũng giảm. Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, thời gian khử trùng với cồn 70⁰ trong 10s (CT1) cho tỷ lệ mẫu sống cao nhất (47,62%) do thời gian ngắn thành tế bào ít bị phá hủy là nhưng tỷ lệ nhiễm cũng cao (52,38%) do chưa đủ để dung dịch khử trùng giết chết các nguồn bệnh. Khi tăng thời gian khử trùng lên 20s (CT2) thì tỷ lệ sống và tỷ lệ nhiễm giảm là 28,57% và 47,62%. Tiếp tục tăng thời gian khử trùng lên 30s (CT3) thì tỷ lệ sống tiếp tục giảm còn 14,29% và 38,1%. Với chất khử trùng là NaClO 2% NaClO 2% là hóa chất có tính sát khuẩn cao nên khi tăng thời gian khử trùng thì tỷ lệ nhiễm sẽ giảm nhưng nếu thời gian khử trùng lâu thì dung dịch có thể xâm nhập vào bên trong gây độc với mẫu. Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, khi khử trùng trong thời gian 5 phút (CT4) thì tỷ lệ nhiếm cao (23,81%) do thời gian chưa đủ để diệt các nguồn bệnh. Khi tăng thời gian khử trùng lên 10 phút (CT5) thì tỷ lệ nhiễm thấp nhất (9,52%), tỷ lệ sống cao (57,14%). Tiếp tục tăng thời gian khử trùng lên tới 15 phút(CT6) dung dịch đã gây độc cho mẫu nên tỷ lệ sống thấp hơn (33,33%), tỷ lệ nhiễm tăng lên. Như vậy, thời gian khử trùng bằng NaClO 2% tốt nhất là trong 10 phút, cho tỷ lệ sống cao và tỷ lệ nhiễm thấp. Khử trùng bằng phương pháp kết hợp giữa cồn 70⁰ và NaClO 2% Khi kết hợp cả hai chất khử trùng trên với thời gian khử trùng thích hợp đã khắc phục được các nhược điểm của từng chất nên cho tỷ lệ sống cao hơn và tỷ lệ nhiễm giảm. Kết quả thí nghiệm cho thấy, phương pháp khử trùng là ngâm cồn 70⁰ trong 10s rồi ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút (CT8) cho tỷ lệ sống cao nhất đạt 90,48% và tỷ lệ nhiễm thấp (28,57%). Như vậy, thời gian khử trùng mẫu có ảnh hưởng khá lớn tới tỷ lệ sống của mẫu cấy. Công thức khử trùng CT8 (ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s rồi ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút) là vừa đủ, vừa có khả năng tiêu diệt mầm bệnh mà lại tác động nhẹ đến thành tế bào nên cho tỷ lệ sống cao và kích thích mẫu
  37. 41. tái sinh. 3.1.2. Xác định cơ quan vào mẫu thích hợp để tạo mẫu sạch và tăng hệ số nhân chồi in vitro Mục tiêu đặt ra của quy trình khử trùng cho bất kỳ loài cây nào đều là tạo được tỷ lệ mẫu sạch cao đồng thời có khả năng tái sinh mạnh. Một trong các yếu tố chính ảnh hưởng đến khả năng này là bản chất vật liệu làm mẫu cấy. Mẫu cấy tiếp xúc với nước, đất như rễ thường có lượng vi sinh vật rất cao và khó loại bỏ hoàn toàn chúng khỏi nguồn mẫu. Mẫu mọng nước, có lông thường khó khử trùng hơn những mẫu không mọng nước, bề mặt nhẵn. Trong nghiên cứu này các vật liệu được khử trùng được khử trùng theo công thức khử trùng tốt nhất suy ra từ kết quả nghiên cứu phần 3.1.1 3.1.2.1. Ảnh hưởng của loại vật liệu đến tỷ lệ tạo mẫu sạch Qua kết quả thí nghiệm 1 cho thấy, điều kiện khử trùng hiệu quả nhất đối với loài Lan Kim tuyến là: Ngâm trong cồn 70o trong 10s sau đó ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút. Do đó, để xác định cơ quan vào mẫu phù hợp nhất thí nghiệm tiếp tục áp dụng điều kiện khử trùng trên với các vật liệu khác nhau của cây lan Kim tuyến là: Chồi đỉnh, chồi nách, mắt đốt ngang thân. Kết quả thu được sau 15 ngày được thể hiện ở Bảng 3.2.
  38. 42. Bảng 3.2. Ảnh hưởng c Cơ quan vào mẫu Chồi đỉnh Chồi nách Mắt đốt ngang thân Hình 2. Ảnh hưởng c Theo kết quả ở bảng đốt ngang thân là vật liệu cho t nhất (16,67%), thứ hai là ch 33,33%, thấp nhất là chồi nách cho t Nguyên nhân của sự khác bi tuyến (Anoecctochilus setaceus số lượng lớn các mầm bệnh gây nhi khử trùng. 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00 Chồi đỉnh ng của loại vật liệu đến tỷ lệ tạo mẫu sạ thu được sau 15 ngày) Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ nhi 66,67 33,33 50,00 27,78 t ngang thân 72,22 16,67 ng của loại vật liệu đến tỷ lệ tạo mẫu sạch được sau 15 ngày) 3.2 và hình 2 cho thấy, khi khử trùng mẫ u cho tỷ lệ sống cao nhất (72,2%) và tỷ ai là chồi đỉnh cho tỷ lệ sống là 66,67% và t i nách cho tỷ lệ sống là 50% và tỷ lệ nhiễ khác biệt này là do đặc điểm thân khí sinh c setaceus) có rất nhiều lông tơ do vậy trên b nh gây nhiễm mẫu, do đó gặp khó khăn trong công tác Chồi nách Mắt đốt ngang thân Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ nhiễm (%) ạch (Kết quả nhiễm (%) 3,33 7,78 6,67 ch (Kết quả thu ẫu cấy thì mắt lệ nhiễm thấp ng là 66,67% và tỷ lệ nhiễm là ễm là 27,78%. m thân khí sinh của Lan Kim y trên bề mặt có một p khó khăn trong công tác Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ nhiễm (%)
  39. 43. Qua kết quả nghiên cứu ở thí nghiệm này cho thấy, cơ quan vào mẫu thích hợp cho việc tạo mẫu sạch là mắt đốt ngang thân. 3.1.2.2. Ảnh hưởng của cơ quan vào mẫu đến hệ số nhân chồi in vitro Cơ quan vào mẫu có ảnh hưởng rõ rệt đến hệ số nhân chồi. Ở một số loài, cơ quan vào mẫu có tỷ lệ mẫu sạch bệnh cao nhất nhưng lại cho hệ số nhân chồi thấp nhất. Do đó, để đạt hiệu quả nhân nhanh chồi in vitro loài lan Kim tuyến, chúng tôi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của cơ quan vào mẫu đến hệ số nhân chồi lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume). Kết quả thí nghiệm thu được thể hiện qua Bảng 3.3. Bảng 3.3. Ảnh hưởng của cơ quan vào mẫu đến hệ số nhân chồi in vitro (kết quả theo dõi sau 8 tuần). Cơ quan vào mẫu Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Hệ số nhân chồi (lần) Chiều cao TB chồi (cm) Chồi đỉnh 33,33 2,11 2,58 Chồi nách 50 3,50 2,97 Mắt đốt ngang thân 100 4,56 3,2 CV% 0 3,6 2,7 LSD0,05 0,01 0,25 0,16 Chồi đỉnh Chồi ngọn Mắt đốt ngang thân Hình 3. Ảnh hưởng của cơ quan vào mẫu đến hệ số nhân chồi Phân tích phương sai một nhân tố với 3 lần lặp của tỷ lệ mẫu sạch, hệ số nhân và chiều cao chồi đều được hiệu của trung bình mỗi công thức lớn hơn LSD0,05 chứng tỏ cơ quan vào mẫu có ảnh hưởng rõ rệt đến tỷ lệ tạo chồi, hệ số
  40. 44. nhân và chiều cao TB chồi ở độ tin cậy 95%. Qua kết quả ở Bảng 3.3 cho thấy, khi cấy các vật liệu là chồi đỉnh, chồi nách, mắt đốt ngang thân vào môi trường nhân nhanh phù hợp, kết quả theo dõi sau 8 tuần cho thấy mắt đốt ngang thân là cơ quan tái sinh và phát triển tốt nhất với tỷ lệ tạo mẫu là 100%, hệ số nhân 4,56 lần, chồi dài 3,2 cm. Cơ quan nhân kém nhất là chồi đỉnh với tỷ lệ tạo chồi chỉ đạt 33,33%, hệ số nhân là 2,11 lần và chiều dài chồi là 2,6 cm. Chồi nách cho tỷ lệ tạo mẫu là 44,44%, hệ số nhân 3,5 lần và chiều dài chồi 2,95 cm. Như vậy, cơ quan vào mẫu thích hợp nhất để tăng hệ số nhân chồi in vitro lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus) là mắt đốt ngang thân. 3.2. Nghiên cứu môi trường khởi động và nhân nhanh thích hợp Trong nuôi cấy in vitro, môi trường nuôi cấy đóng vai trò quan trọng. Vừa phải cung cấp chất dinh dưỡng cho mẫu vừa phải biệt hoá mẫu theo những hướng xác định. Do đó nghiên cứu lựa chọn môi trường nuôi cấy phù hợp nhất sẽ cho hệ số nhân cao, chất lượng chồi tốt. 3.2.1. Xác định môi trường nền thích hợp cho nuôi cấy mô Lan Kim tuyến (A. setaceus) Những nghiên cứu về nuôi cấy Phong lan in vitro cho thấy có một số môi trường thích hợp để nuôi cấy Phong lan như: MS; môi trường Knudson C cho Cattleya, Cymbidium (Adirti, 1993), môi trường Knudson cải tiến (Knud*), môi trường Hyponex (Lou and Kako,1995; Nakano et al, 2000…), môi trường Vaccin &Went… Trong đề tài này chúng tôi nghiên cứu nuôi cấy loài Lan Kim tuyến trên ba loại môi trường cơ bản: MS, Knudson C và Knud*. Thể chồi 4 tuần tuổi từ môi trường vào mẫu được cấy vào các môi trường khác nhau là MS, Knud*, Knudson có bổ sung thêm 20g/l sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar. Sau 8 tuần nuôi cấy ta thu được kết quả sau:
  41. 45. Bảng 3.4. Ảnh hưởng của môi trường nền đến khả năng nhân nhanh chồi, mắt đốt lan Kim tuyến Môi trường Số chồi (chồi/mẫu) Chiều cao TB chồi (cm) Số lá (lá/chồi) Đặc điểm thể chồi Knud* 3,67 3,57 4,12 Mập, xanh MS 2,11 1,33 1,55 Gầy, xanh nhạt Knudson C 2.06 2,22 2,35 Bé, xanh nhạt CV% 3,1 2,2 2,4 LSD0,05 0,16 0,11 0,12 MS Knud* Knudson C Hình 4. Ảnh hưởng của môi trường nền đến khả năng nhân nhanh chồi Kết quả phân tích phương sai cho thấy, môi trường nền có ảnh hưởng tới khả năng nhân nhanh chồi, mắt đốt lan Kim tuyến. Theo kết quả ở Bảng 3.4 thấy rằng môi trường Knud* cho số lượng chồi (3,67 chồi/mẫu) và số lá (4,12 lá/chồi) nhiều hơn ở môi trường MS (số lượng chồi 2,11 chồi/mẫu và số lá 1,55 lá/chồi) và Knudson (số lượng chồi 2,06 chồi/mẫu và số lá 2,35 lá/chồi). Đồng thời, trong môi trường Knud* thì chiều dài chồi (3,57cm) dài hơn hẳn so với hai môi trường còn lại (MS là 1,33 cm và Knudson là 2,22 cm) và chất lượng chồi cũng tốt hơn chồi mập, xanh. Như vậy, môi trường nền thích hợp nhất cho nuôi cấy mô lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus) là nuôi trường có nguồn gốc Knud*.
  42. 46. 3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất điều hòa sinh trưởng riêng rẽ và phối hợp đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân Chất điều hoà sinh trưởng không những là công cụ hữu ích giúp chúng ta nghiên cứu sâu hơn về sự phát sinh hình thái thực vật mà còn giúp ta chủ động định hướng cho sự phát triển của thực vật trong ống nghiệm. Đặc biệt với mục đích nhân giống tạo số lượng lớn trong thời gian ngắn thì việc sử dụng các loại chất điều tiết sinh trưởng ở nồng độ khác nhau cho tỷ lệ mẫu tái sinh lớn nhất là tất yếu. 3.2.2.1. Ảnh hưởng của nhóm chất Cytokinin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân Cytokinin được biết đến là nhóm chất điều hòa sinh trưởng có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trưởng của chồi in vitro (Miller, 1961). Để tăng hệ số nhân giống, người ta tăng nồng độ cytokinin trong môi trường nuôi cấy ở giai đoạn tạo chồi in vitro (Nguyễn Quang Thạch, 2007). Các loại cytokinin thường được sử dụng trong nuôi cấy như: BAP, Kinetin, TDZ, Zeatin… Trong thí nghiệm này, hai loại cytokinin là BAP và Kinetin được dùng với các nồng độ khác nhau là 0,1; 0,5; 1,0 và 2,0 mg/l trên môi trường (Knud* + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar). Kết quả thu được ở Bảng 3.5.
  43. 47. Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nhóm chất Cytokinin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân (kết quả theo dõi sau 8 tuần) Cytokinin Nồng độ (mg/l) Số chồi (chồi/mẫu) Số đốt (đốt/chồi) Chiều cao TB chồi (cm) Đặc điểm chồi 0 (ĐC) 0 1,22 1,54 2,32 Gầy, xanh nhạt BAP 0,1 2,44 2,16 3,03 Yếu, xanh nhạt 0,5 3,94 2,31 3,16 Khỏe, xanh đậm 1,0 5,22 2,93 3,23 Khỏe, xanh đậm 2,0 4,22 2,37 3,02 Xanh nhạt, có lông tơ CV% 2,8 2,4 1,6 LSD0,05 0,17 0,1 0,085 Kinetin 0,1 2,33 1,98 2,45 Yếu, xanh nhạt 0,5 4,22 2,45 3,05 Khỏe, xanh đậm 1,0 4,89 2,68 3,23 Khỏe, xanh đậm 2,0 3,22 2,02 3,08 Xanh nhạt CV% 2,6 2,7 1,6 LSD0,05 0,15 0,1 0,081 0,1 0,5 1,0 2,0 (mg/l) Ảnh hưởng của BAP 0,1 0,5 1,0 2,0 (mg/l) Ảnh hưởng của Kinetin Hình 5. Ảnh hưởng của nhóm chất cytokinin tới sự phát sinh hình thái và hệ số nhân
  44. 48. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân chồi Kết quả xử lý thống kê hàm Anova một nhân tố cho thấy, giữa các công thức có sự khác biệt rõ rệt về số lượng chồi, số đốt và chiều cao chồi ở độ tin cậy 95% và khác biệt so với đối chứng. Theo kết quả thu được ở Bảng 3.5 cho thấy, môi trường có bổ sung 1,0 mg/l BAP cho số chồi và số đốt cao hơn nhất (5,22 chồi/mẫu và 2,93 đốt/chồi), chiều cao chồi cũng lớn nhất (3,23 cm). Ở các môi trường có nồng độ BAP khác thì thấp hơn, số lượng chồi khi sử dụng nồng độ 0,1 mg/l BAP là 2,44 chồi/mẫu, ở nồng độ 0,5 mg/l BAP là 3,94 chồi/mẫu, ở nồng độ 2,0 mg/l là 4,22 chồi/mẫu và đối chứng là 1,22 chồi/mẫu, số đốt khi sử dụng các nồng độ 0,1; 0,5; 2,0 mg/l BAP lần lượt là 2,16; 2,33; 2,35 đốt/chồi và đối chứng là 1,54 đốt/chồi. Về chất lượng chồi thì ở nồng độ 1,0 mg/l BAP cũng cho chất lượng chồi tốt nhất chồi to khỏe, xanh đậm còn ở nồng độ 0; 0,1 và 2,0 mg/l thì do nồng độ quá cao và quá thấp nên chồi nhỏ và yếu, xanh nhạt. Như vậy, việc bổ sung BAP ở nồng độ 1,0 mg/l là thích hợp nhất cho sự phát sinh hình thái và hệ số nhân chồi lan Kim tuyến. Ảnh hưởng của Kinetin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân chồi Kết quả xử lý thống kê hàm Anova một nhân tố cho thấy, giữa các công thức có sự khác biệt rõ rệt về số lượng chồi, số đốt và cả chiều cao chồi ở độ tin cậy 95% và khác biệt so với đối chứng. Theo kết quả thu được ở Bảng 3.5 cho thấy, môi trường có bổ sung 1,0 mg/l Kinetin cũng cho số chồi và số đốt cao hơn nhất (4,91 chồi/mẫu và 2,68 đốt/chồi), chiều cao chồi cũng lớn nhất (3,23 cm). Ở các môi trường có nồng độ Kinetin khác thì thấp hơn, số lượng chồi dao động từ 2,33 – 4,22 chồi/mẫu, số đốt dao động từ 1,98 – 2,45 đốt/chồi. Về chất lượng chồi thì ở nồng độ 1,0 mg/l BAP cũng tốt nhất chồi to khỏe, xanh đậm còn ở nồng độ 0; 0,1 và 2,0 mg/l thì chồi nhỏ, xanh nhạt.
  45. 49. Như vậy, bổ sung Kinetin cũng ở nồng độ 1,0 mg/l là thích hợp nhất cho sự phát sinh hình thái và hệ số nhân chồi lan Kim tuyến. 3.2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA và αNAA đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân lan Kim tuyến (A. setaceus) Tác dụng rõ nét nhất của auxin đối với sự phân hóa tế bào là khả năng phát sinh rễ đã được kiểm chứng từ năm 1934 (Went, Skoog, Thimann). Nhiều nghiên cứu đã cho thấy vai trò của IBA và αNAA tác động đến quá trình phát sinh rễ trên nhiều đối tượng nghiên cứu như cây lát hoa Côn Đảo, tram Úc… (Trần Văn Minh và Cộng sự, 2003; Nguyễn Văn Nghi và Cộng sự, 2003). Để kiểm tra ảnh hưởng của auxin (IBA và NAA) tới sự phát sinh hình thái và hệ số nhân, thí nghiệm này được tiến hành trên môi trường Knud* và bổ sung riêng rẽ IBA và αNAA với các nồng độ khác nhau 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 3,0mg/l + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 7g/l agar. Kết quả thu được ở Bảng 3.6.
  46. 50. Bảng 3.6. Ảnh hưởng của auxin (IBA và αNAA) tới sự phát sinh hình thái lan Kim tuyến Auxin (mg/l) Chiều dài chồi (cm) Số chồi (chồi/mẫu) Số đốt (đốt/chồi) Chiều dài TB rễ (cm) Số rễ (rễ/chồi) Đặc điểm chồi 0 (ĐC) 3,33 1,33 2,13 0,92 2,04 Xanh nhạt, lá bé IBA 0,5 3,12 3,28 2,31 1,12 1,43 Xanh nhạt, có lông tơ 1,0 3,22 3,36 2,52 0,88 1,10 Xanh đậm, lá bé 1,5 3,55 4,87 2,66 0,98 0,96 Xanh đậm, lá to 2,0 3,23 2,28 2,39 1,05 0,83 Xanh nhạt, lá bé 3,0 2,12 2,33 2,58 1,17 0,71 Xanh nhạt, lá bé CV% 2,2 4,1 3,7 3,3 3,5 LSD0,05 0,13 0,095 0,16 0,059 0,13 αNAA 0,5 3,23 3,06 2,54 1,57 1,68 Bé, xanh nhạt 1,0 3,41 4,56 2,87 1,33 2,20 Xanh đậm, Lá to 1,5 3,33 3,78 2,30 0,83 1,42 Bé, xanh nhạt 2,0 3,37 3,11 1,97 1,32 1,32 Bé, xanh nhạt 3,0 3,67 2,67 1,79 1,12 1,21 Bé, xanh nhạt CV% 1 2,9 4 2,4 2,1 LSD0,05 0,6 0,14 0,16 0,051 0,13


【#3】Nghiên Cứu Nhân Nhanh In Vitro Loài Lan Kim Tuyến (Anoectochilus Setaceus Blume) Nhằm Bảo Tồn Nguồn Dược Liệu Quý

Đặt vấn đề

Từ xưa đến nay, lan vẫn được biết đến như một loài hoa quý phái, hoa của bậc vua chúa vương giả. Lan được phát hiện đầu tiên vào những năm 40 của thế kỷ VIII, cho đến nay đã có hơn 15.000 loại lan trồng khác nhau trên trên thế giới.

Tại Việt Nam, hoa lan cũng vô cùng đa dạng phong phú, có khoảng hơn 1.000 loài hoa các loại, chúng sinh sản tại các vùng rừng, núi như Cao Bằng, Lào Cai, Huế, Quy Nhơn, Đà Lạt, Pleiku, … lan Việt Nam đẹp thanh cao lại chứa đựng nhiều ý nghĩa, có rất nhiều cây quý hiếm và có những cây trước kia chỉ thấy mọc ở Việt Nam (như lan nữ hài Paphiopedilum delenati).

Họ lan (Orchidaceae) là một trong số những họ thực vật đa dạng nhất của Việt Nam, với tổng số khoảng 865 loài thuộc 154 chi. Thông thường lan được sử dụng làm cảnh. Ngoài ra, có nhiều loài lan còn được sử dụng làm thuốc.

Chi lan Kim tuyến Anoectochilus ở Việt Nam hiện thống kê được 12 loài, trong đó có loài lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume, tên khác Anoectochilus roxburghii Wall. ex Lindl. phân bố rộng ở hầu hết các tỉnh trong cả nước, được biết đến nhiều không những bởi giá trị làm cảnh, mà bởi giá trị làm thuốc của nó. Do bị thu hái nhiều để bán làm thuốc từ rất lâu, nên loài lan Kim tuyến đang bị đe dọa nghiêm trọng, rất có thể sẽ bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên nếu chúng ta không có biện pháp bảo tồn hữu hiệu. Hiện nay, lan Kim tuyến được cấp báo trong Nghị định 32/2006/NĐ-CP thuộc nhóm IA, nghiêm cấm khai thác sử dụng vì mục đích thương mại và nhóm thực vật rừng đang nguy cấp EN A1a,c,d, trong sách đỏ Việt Nam 2007. Vì vậy, nghiên cứu kỹ thuật nhân giống loài lan Kim tuyến – Anoectochilus setaceus Blume được triển khai sẽ cung cấp những cơ sở khoa học và thực tiễn để tạo ra hàng loạt những cây con ổn định về mặt di truyền nhằm bảo tồn và phát triển loài dược liệu nguy cấp, quí hiếm này.

Xuất phát từ những cơ sở đó, chúng tôi đã lựa chọn và thực hiện nghiên cứu đề tài:”Nghiên cứu nhân nhanh in vitro loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) nhằm bảo tồn nguồn dược liệu quý”.

I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu chung về cây Lan Kim tuyến

Chi lan Kim tuyến (Anoectochilus) còn được gọi là lan trang sức vì vẻ đẹp hấp dẫn của nó, được Carlvon Blume mô tả đầu tiên năm 1810 thuộc phân họ Orchidoideae. Trên thế giới đã thống kê được 51 loài. Ở Việt Nam hiện thống kê được 12 loài, trong đó loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) được biết đến chủ yếu với công dụng làm thuốc.

Lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume)

Đồng danh là (Anoectochilus roxburghi Wall.)

Họ: Phong lan (Orchidaceae)

Bộ: Phong lan (Orchidales)

Đây là loài đơn thân, mọc ở đất, có thân rễ mọc dài; thân trên đất mọng nước và có nhiều lông mềm, mang 2 – 4 lá mọc xoè sát đất. Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, chóp hơi nhọn và có mũi ngắn, cỡ 3 – 4 x 2 – 3 cm, mặt trên màu nâu thẫm có vệt vàng ở giữa và màu hồng nhạt trên các gân, mặt dưới màu nâu nhạt. Cuống lá dài 2 – 3 cm. Cụm hoa dài 10 – 15 cm, mang 4 – 10 hoa mọc thưa. Lá bắc hình trứng, dài 8-10 mm, màu hồng. Hoa thường màu trắng, dài 2,5 – 3 cm; môi dài đến 1,5 cm, ở mỗi bên gốc mang 6 – 8 dải hẹp, chẻ đôi thành 2 thuỳ hình thuôn tròn. Bầu dài 13mm, có lông thưa.

Mùa hoa tháng 2, tháng 4. Tái sinh bằng chồi từ thân rễ và hạt ít, sinh trưởng rất chậm. Là loại cây ưa bóng, kỵ ánh sáng trực tiếp thường mọc dưới tán rừng nguyên sinh, rừng rậm nhiệt đới ở độ cao 500 – 1600m. Mọc rải rác vài ba cây trên đất ẩm, giàu mùn và lá cây rụng.

Phân bố: Việt Nam: Lào Cai (Sapa), Hà Giang (Quản Bạ), Yên Bái, Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Hà Tây (Mỹ Đức: Chùa Hương), Quảng Trị (Đồng Chè), Kontum (Đắc Tô: Đắc Uy), Gia Lai (Kbang: Kon Hà Nừng)….Thế giới: Trung Quốc (Vân Nam, Quảng Đông), Ấn Độ, Lào, Inđônêxia,…

Tác dụng dược lý: Lan Kim tuyến là loài cây thuốc rất đặc biệt có tác dụng tăng cường sức khoẻ, làm khí huyết lưu thông, có tính kháng khuẩn, chữa các bệnh viêm khí quản, viêm gan mãn tính, chữa suy nhược thần kinh. Loài lan này được dùng làm thuốc chữa bệnh trị lao phổi, phong thấp, đau nhức khớp xương, viêm dạ dày mãn tính (Nguyễn Tiến Bân, Dương Đức Huyến). Trước đó, lan Kim tuyến (A. setaceus) là một trong những dược thảo quý giá, giúp bổ máu, dưỡng âm, chữa trị nóng phổi và nóng gan (Tạ A Mộc và Trần Kiến Đào, 1958). Hơn nữa mới đây người ta đã phát hiện ra khả năng phòng và chống ung thư của loại thảo dược này.

Theo các tài liệu nghiên cứu của Trung Quốc công bố gần đây bằng kỹ thuật sắc ký lỏng, sắc ký cột và kỹ thuật quang phổ đã phân lập, xác định được cấu trúc hoá học và thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất có trong loài lan Kim tuyến (Tạp chí “Sinh học thực vật tổng hợp Trung Quốc”, tập 48 số 3, tháng 3/2006, trang 359-363). Bằng các kỹ thuật quang phổ đã xác định được 8 hợp chất hoá học. Các hợp chất này đều có hoạt tính sinh học mạnh, có khả năng làm giảm các gốc tự do trong cơ thể, nên có khả năng phòng bệnh rất tốt. Đặc biệt có hai axít hữu cơ được phân lập là Olenolic acid và Ursolic acid có khả năng chống ung thư, giảm cholesterol máu, chống tăng huyết áp, kháng khuẩn…

1.1.1. Đặc điểm hình thái

Lan Kim tuyến là cây thảo, mọc ở đất, có thân rễ mọc dài; thân trên đất mọng nước, mang các lá mọc xòe sát đất.

a. Thân rễ

Lan Kim tuyến là cây thân rễ nằm ngang sát mặt đất, đôi khi hơi nghiêng, bò dài. Chiều dài thân rễ từ 5-12 cm, trung bình là 7,87 cm. Đường kính thân rễ từ 3-4 mm, trung bình là 3,17 mm. Số lóng trên thân rễ từ 3-7 lóng, trung bình là 4,03 lóng. Chiều dài của lóng từ 1-6 cm, trung bình là 1,99 cm. Thân rễ thường có màu xanh trắng, đôi khi có màu nâu đỏ, thường nhẵn, không phủ lông.

b. Thân khí sinh

Cây lan Kim tuyến có thân khí sinh thường mọc thẳng đứng trên mặt đất, ít khi mọc nghiêng. Chiều dài thân khí sinh từ 4-8 cm, trung bình 6 cm. Đường kính thân khí sinh từ 3- 5 mm, trung bình là 3,08 cm. Thân khí sinh mang nhiều lóng, các lóng có chiều dài khác nhau. Số lóng trên thân khí sinh thay đổi từ 2-4 lóng, trung bình là 2,87. Chiều dài mỗi lóng từ 1-4 cm, trung bình 2,23 cm. Thân khí sinh thường mọng nước, nhẵn, không phủ lông; thường có màu xanh trắng, đôi khi có màu hồng nhạt.

c. Rễ

Rễ lan Kim tuyến được mọc ra từ các mẫu trên thân rễ. Đôi khi rễ cũng được hình thành từ thân khí sinh. Rễ thường đâm thẳng xuống đất. Thông thường mỗi mẫu chỉ có một rễ, đôi khi có vài rễ cùng được hình thành từ một mấu trên thân rễ. Số lượng và kích thước rễ cũng rất thay đổi tuỳ theo cá thể. Số rễ trên một cây thường từ 3 – 10, trung bình là 5,4. Chiều dài của rễ thay đổi từ 0,5 – 8 cm, rễ dài nhất trung bình là 6,07cm và ngắn nhất trung bình là 1,22 cm, chiều dài trung bình của các rễ trên một cây là 3,82 cm.

d. Lá

Lá lan Kim tuyến mọc cách xoắn quanh thân, xoè trên mặt đất. Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, đầu lá hơi nhọn và có mũi ngắn, thường dài từ 3 – 5 cm, trung bình là 4,03 cm và rộng từ 2 – 4 cm, trung bình là 3,12 cm. Lá có màu nâu đỏ ở mặt trên và phủ lông mịn như nhung. Hệ gân lá mạng lưới lông chim, thường có 5 gân gốc. Các gân này thường có màu hồng ở mặt trên và nổi rất rõ. Đôi khi gân ở giữa có màu vàng nhạt. Mặt dưới lá có màu nâu đỏ nhạt, nhẵn với 5 gân gốc nổi rõ. Các gân bên ở phía rìa lá nổi rõ, gân ở giữa lá ở mặt dưới không rõ. Cuống lá dài 0,6 – 1,2 cm, thường nhẵn và có màu trắng xanh, đôi khi hơi đỏ tía ở bẹ lá. Bẹ lá nổi rõ và nhẵn. Số lá trên một cây thay đổi từ 2 – 6, thông thường có 4 lá. Kích thước của lá cũng thay đổi, các lá trên một cây thường có kích thước khác nhau rõ rệt.

e. Hoa, quả

Hoa lan Kim tuyến dạng cụm, dài 10 – 20 cm ở ngọn thân, mang 4 – 10 hoa mọc thưa. Lá bắc hình trứng, dài 6 – 10 mm, màu hồng. Các mảnh bao hoa dài khoảng 6 mm; cánh môi màu trắng, dài đến 1,5 cm, ở mỗi bên gốc mang 6 – 8 dải hẹp, đầu chẻ đôi. Mùa hoa tháng 10 – 12. Mùa quả chín tháng 12 – 3 năm sau.

1.1.2. Đặc điểm phân bố

1.1.2.1. Phân bố theo kiểu rừng: Kết quả điều tra đã chỉ ra rằng, hiện nay lan Kim tuyến hầu hết phân bố ở kiểu rừng kín lá rộng thường xanh á nhiệt đới núi thấp, cấu trúc rừng thường có 2 tầng cây gỗ. Đôi khi có thể gặp lan Kim tuyến ở kiểu rừng kín lá rộng thường xanh mưa mùa nhiệt đới.

– Tầng ưu thế sinh thái A2: Độ tán che thường từ 85-90%, với các loài cây gỗ chủ yếu như: Chắp tay bắc bộ (ExbuckLandia tonkinensis), Chắp tay (ExbuckLandia populnea), Thích các loại (Acer spp.), Trương vân (Toona surenii), Gội nếp (Aglaia spectabilis), Trám trắng (Canarium album), Kháo thơm (Machilus odoratissima), Sồi phảng (Lithocarpus cerebrinus), Dẻ gai bắc bộ (Castanopsis tonkinensis), Trâm trắng (Syzygium chanlos), Côm tầng (Elaeocarpus griffithii), Trâm tía (Syzygium sp.), Vỏ sạn (Osmanthus spp.), Thừng mực mỡ (Wrightia laevis), Máu chó (Knema spp.), v.v. Chiều cao của tầng A2 từ 15-25 m.

– Tầng cây gỗ A3: Bao gồm các loài cây của tầng trên còn nhỏ và các loài cây của tầng dưới như: Hoa trứng gà (Magnolia coco), Trứng gà 3 gân (Lindera sp.), Phân mã tuyến nổi (Archidendron chevalieri), Phân mã (Archidendron balansae), Mắc niễng (Eberhardtia tonkinensis), Nanh chuột (Cryptocarya lenticellata), Re hương (Cinnamomum iners), Re bầu (Cinnamomum bejolghota), Mò roi (Litsea balansae), Trà hoa vàng (Camelia spp.), Xoan đào (Prunus arborea), Trọng đũa (Ardisia spp.), v.v. Chiều cao của tầng A3 từ 815m.

– Tầng cây bụi B: Gồm các loài thực vật như Mua đất (Melastoma sp.), Ớt sừng lá nhỏ (Kibatalia mycrophylla), Lấu (Psychotria rubra), Ớt rừng (Clausena sp.), Bọt ếch (Glochidion hirsutum), v.v…

– Tầng cỏ quyết: Bao gồm chủ yếu các loài Thường sơn (Dichroa febrifuga), Cao cẳng (Ophiopogon spp.), Gừng một lá (Zingiber monophyllum), Giềng tàu (Alpinia chinensis), Sẹ (Alpinia tonkinensis), Mía dò (Costus speciosus), Mía dò bắc bộ (Costus tonkinensis), Râu hùm (Tacca spp.), Cỏ lá tre (Centosteca latifolia), Rớn đen (Adiantum flabellulatum), Hèo (Calamus rhabdocladus), Lòng thuyền (Curculigo gracilis), Móc (Caryota mitis), v.v…

– Thực vật ngoại tầng: Bao gồm các loài thuộc chủ yếu các họ Mã Tiền (Loganiaceae), họ Cau (Arecaceae), họ Na (Annonaceae), họ Kim cang (Smilacaceae), họ Củ nâu (Dioscoreaceae), họ Cà phê (Rubiaceae), họ Đậu (Fabaceae), họ Vang (Caesalpiniaceae), họ Trinh nữ (Mimosaceae), họ Ráy (Araceae), họ Thiên lý (Asclepiadaceae), họ Bòng bong (Schizaeaceae). Điển hình như: Dây hoa dẻ (Desmos chinensis), Dây dất na (Desmos spp.), Dây kim cang các loại (Smilax spp.), Củ nâu (Dioscorea cirrhosa), Móc câu đằng (Uncaria sp.), Ráy leo (Pothos scandens), Dây sưa (Dalbergia candenatensis), Dây móng bò (Bauhinia sp.), Bòng bong các loại (Ligodium spp.), Dây thèm bép (Tetrastigma rupestre), v.v…

– Mật độ phân bố: Của Lan Kim tuyến ở đây là rất thấp, trung bình khoảng 20 cây/ha. Chúng phân bố rải rác ở một số điểm thuộc khu vực nghiên cứu.

1.1.2.2. Phân bố lan Kim tuyến theo trạng thái rừng và sinh cảnh

– Theo trạng thái rừng: Kết quả điều tra đã khẳng định, lan Kim tuyến phân bố tập trung chủ yếu ở trạng thái rừng IIIA2, thuộc vùng lõi của Vườn quốc gia. Độ tán che của trạng thái rừng này từ 85-90%. Đặc điểm của cây bụi và thảm tươi ở khu vực Lan Kim tuyến phân bố là thưa thớt, độ che phủ thấp thường vào khoảng từ 15-30%, với độ cao của lớp cây bụi và thảm tươi khoảng từ 0,1-0,5m tuỳ từng khu vực. Lan Kim tuyến thường ít phân bố ở những nơi cây bụi thảm tươi dày đặc. Chúng có thể nằm ngay trên lớp thảm mục của rừng đang bị phân huỷ.

– Về sinh cảnh: Lan Kim tuyến chủ yếu phân bố trên đất, chúng mọc sát ngay bề mặt đất, nơi đất giàu mùn, độ ẩm và độ xốp cao, thoáng khí; thậm chí ngay trên lớp thảm mục của rừng đang phân huỷ. Đôi khi chúng mọc trên các tảng đá ẩm, trên các đoạn thân cây gỗ mục, trong gốc cây. Có thể bắt gặp lan Kim tuyến ở trong rừng nơi ẩm ướt, ven các khe suối, dưới tán rừng cây gỗ lớn, hoặc dưới rừng trúc, rừng sặt, trên đường mòn đi lại trong rừng.

1.1.2.3. Phân bố lan Kim tuyến theo địa lý, địa hình và đai cao

– Về địa lý, địa hình: Có thể gặp chúng ở hầu hết các dạng địa hình, như chân núi, sườn núi, đỉnh núi.

– Về đai cao: Lan Kim tuyến thường phân bố ở đai cao trên 735m, tập trung chủ yếu ở độ cao trên 970m, quanh núi Rùng Rình.

1.2. Nhân giống cây lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus)

1.2.1. Nhân giống bằng hạt

Nhân giống bằng hạt hay con gọi là nhân giống hữu tính, trong thiên nhiên sự thụ phấn của lan do côn trùng thực hiện, cấu trúc hoa hoàn toàn thích ứng với sự thụ phấn đó. Hoa lan là một loại hoa lưỡng tính, nhưng do cấu trúc của hoa và sự chín của các cơ quan sinh dục trong hoa không đều nên sự giao phấn nhờ sâu bọ có tính bắt buộc đối với tất cả các loài setaceus. Sự thụ phấn của hoa trong môi trường tự nhiên được côn trùng thực hiện trên cơ sở của mùi thơm, mật, màu sắc sặc sỡ và những cấu tạo của hoa là những nhân tố chính để thu hút các tác nhân thụ phấn từ khoảng cách xa.

Ở vườn nuôi trồng lan để đảm bảo kết quả của sự giao phấn cao và tạo ra các giống lai theo ý muốn, con người phải tiến hành thụ phấn nhân tạo. Sự thụ phấn có thể cùng cây, có thể khác cây.

Phương pháp này có nhiều ưu điểm: Dễ làm, giá thành hạ, thu được nhiều cây khoẻ, không bị bệnh, ngoài ra do đặc điểm giao phấn chéo có thể thu được những dòng biến dị cho vật liệu chọn tạo giống. Tuy nhiên trong thực tế hạt Lan Kim tuyến rất hiếm, số lượng hạt rất nhiều nhưng tỉ lệ nảy mầm ít, hơn nữa thời gian khá lâu để cây ra hoa có chất lượng tốt.

1.2.2. Nhân giống bằng cây con

Khi rễ cây con tương đối nhiều, cây có từ 3-5 lá, cây cứng cáp có thể tách để trồng riêng. Đây là cách nhân giống đơn giản và dễ làm nhất.

1.2.3. Phương pháp giâm cây

Lấy một giả hành cắt ra làm nhiều đoạn, mỗi đoạn có nhiều mấu. Đặt các đoạn này vào một nơi ẩm; chỉ cần cát và rêu. Sau vài tuần sẽ xuất hiện những cây con có thể đem trồng vào các chậu mới.

Phương pháp này là phương pháp cổ điển, dễ làm, quen với tập quán, kinh nghiệm của người lao động, giá thành thấp. Tuy nhiên phương pháp này cũng có một số trở ngại như: chậm (tăng khoảng 2-4 cây/năm), chất lượng giống không cao, cây hoa trồng lâu bị thoái hoá, bệnh virus có nhiều khả năng lan truyền và phát triển, từ đó làm giảm phẩm chất hoa (Nguyễn Xuân Linh, 1998)[5a].

1.2.4. Nhân giống in vitro

Nhân giống in vitro là một trong 4 lĩnh vực ứng dụng chính của công nghệ tế bào thực vật và đã mang lại hiệu quả kinh tế lớn nhất (Lê Trần Bình,

1997)

Kỹ thuật nhân nhanh in vitro nhằm phục vụ các mục đích sau:

Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm và làm vật liệu cho công tác tạo giống.

Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các loại cây trồng khác nhau như cây lương thực có củ, các loại cây rau, cây hoa, cây cảnh, cây dược liệu thuộc nhóm thân thảo.

Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quý của giống cây lâm nghiệp và gốc ghép trong nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh thuộc nhóm cây thân gỗ.

Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng và cách ly tái nhiễm kết hợp với làm sạch virus.

Bảo quản các tập đoàn giống nhân vô tính và các loại cây giao phấn trong ngân hàng gen.

1.2.4.1. Cơ sở khoa học của nhân giống in vitro

Tính toàn năng của tế bào (totipotency), từ năm 1902 nhà khoa học người Đức HaberLandt đã đề xướng ra phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh cho tính toàn năng của tế bào thực vật. Theo ông, mỗi tế bào được lấy từ bất kỳ cơ quan sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Khả năng này do mỗi tế bào đều chứa bộ gen mang thông tin di truyền của toàn bộ cơ thể, khi được đặt vào môi trường thích hợp tế bào này sẽ có khả năng giống như một hợp tử ban đầu.

Một đặc tính quan trọng khác, làm cơ sở cho nuôi cấy mô tế bào thực vật là khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào. Khả năng biệt hóa là sự biến đổi của tế bào từ tế bào phôi thành toàn bộ các tế bào chức năng trong các cơ quan của cơ thể. Ngược lại, khi được đặt vào môi trường thích hợp, các tế bào chuyên hóa của cơ thể có thể trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên sinh ra nó – tế bào phôi. Tuy nhiên, thực tế nghiên cứu đã chứng minh, khả năng phản biệt hóa của các tế bào là khác nhau, các tế bào chuyên hóa sâu như tế bào của hệ thống mạch dẫn thực vật, tế bào thần kinh động vật, khả năng biệt hóa rất khó xảy ra. Đối với thực vật, khả năng hình thành cơ quan hay cơ thể giảm dần theo chiều từ ngọn xuống gốc (Galson, 1986; Murashige, 1974).

Trong tự nhiên, tất cả các loài sinh vật đều tồn tại trong mình tiềm năng sinh sản dù là vô tính hay hữu tính, như thế các loài mới có thể duy trì được kiểu gen của mình, chiến thắng trong quá trình tiến hóa. Nhưng ngay từ khi ra đời, công nghệ nuôi cấy mô đã trở thành công cụ đắc lực phục vụ mục đích nhân giống của con người. Vậy tại sao lại phải tiến hành nhân giống in vitro? Chúng ta hãy xem xét những ý nghĩa to lớn mà nó mang lại cho nhân loại.

1.2.4.2. Ý nghĩa của nhân giống in vitro

Nuôi cấy mô tế bào thực vật, thực chất là một phương pháp nhân giống vô tính. Đối với nhiều loại thực vật quý hiếm, có giá trị kinh tế và ý nghĩa sinh học cao, gặp khó khăn trong vấn đề nhân giống hữu tính thì nhân giống vô tính in vitro là công cụ vô cùng hữu ích. Nhưng trên thực tế có nhiều loại thực vật nhân giống hữu tính bằng hạt có hệ số nhân cao nhưng vẫn tiến hành nhân giống vô tính in vitro là do:

Các phương pháp nhân giống hữu tính bằng hạt mặc dù cho hệ số nhân giống cao, dễ bảo quản và vận chuyển nhưng với một số cây trồng, khi nhân giống bằng hạt sẽ cho các cây con không hoàn toàn giống bố mẹ cả về hình thái và thành phần hóa học (Calson, 1964). Sự không đồng nhất này gây ra khó khăn trong việc đưa cây vào sản xuất theo dây truyền công nghiệp, vì các cây có chất lượng sản phẩm không đồng đều, làm giảm giá trị thương phẩm. Đặc biệt, đối với các cây thuốc thì việc không đồng nhất về chất lượng hay chính là hàm lượng các chất hoạt tính sẽ dẫn đến hậu quả là nguyên liệu không ổn định, không đáp ứng được nhu cầu sản xuất. Ví dụ: đối với các cây lấy tinh dầu, việc nhân giống bằng hạt dẫn tới sự phân ly không đều về hàm lượng các thành phần hoạt chất. Theo Nilov (1936), cây Lavanda khi nhân giống bằng hạt, hàm lượng tinh dầu ở cây con phân ly từ 0,5 đến 11,3 %, hàm lượng lynalylacetat từ 11 đến 78 %; cây bạc hà nhân giống hữu tính có sự phân ly rất lớn về hàm lượng và thành phần tinh dầu (Bùi Thị Hằng, Popov, 1975; Bogonina, 1969; Murray, 1960)…

Để khắc phục những nhược điểm trên, phương pháp nhân giống vô tính được áp dụng đã mang lại nhiều hiệu quả kinh tế và ý nghĩa sinh học lớn. Phương pháp nhân giống vô tính đã khắc phục được nhiều nhược điểm của nhân giống hữu tính, ưu điểm lớn nhất của nhân giống vô tính là các cây con đồng đều về mặt di truyền do duy trì được các tính trạng của cây mẹ (Petrop, 1989), nên có thể áp dụng sản xuất đại trà cho sản phẩm có chất lượng ổn định; rút ngắn thời gian từ khi trồng đến thu hoạch tạo điều kiện cho tăng vụ, tăng sản lượng đối với những cây có thời gian nảy mầm của hạt kéo dài… Mặc dù vậy, phương pháp nhân giống vô tính truyền thống (chiết, giâm, ghép) vẫn còn nhiều nhược điểm như sự lây nhiễm bệnh qua nguyên liệu thường phổ biến và phức tạp, hệ số nhân thấp: cam thảo là 5 – 7 (Shah, Dalal, 1980), bạc hà piperita là 2-3 (Foldeli, Havas, 1979), … hơn nữa, việc sử dụng chính các bộ phận làm thuốc để nhân giống rất lãng phí, tốn kém.

Để khắc phục các nhược điểm của phương pháp nhân giống vô tính truyền thống, một phương pháp nhân giống khác đã áp dụng rộng rãi trên thế giới cũng như ở Việt Nam, đó là phương pháp nhân giống in vitro, phương pháp này có nhiều ưu điểm nổi trội như:

– Hệ số nhân giống cao, từ một cây trong vòng một năm có thể tạo thành hàng triệu cây. Hệ số nhân giống ở các loại cây khác nhau nằm trong phạm vi 36 đến 1012 / năm, cao hơn bất cứ phương thức nhân giống nào. Ví dụ: từ một củ khoai tây, sau 8 tháng nhân giống người ta thu được 2000 triệu củ đồng nhất di truyền, được trồng trên một vùng rộng 40 ha, có nghĩa là tốc độ nhân giống vô tính lớn hơn 100.000 lần so với sinh sản hữu tính (Senez, 1987).

– Tính đồng nhất và ổn định di truyền cao: Các cây con được tạo ra giống hệt với cây bố mẹ ban đầu. Theo lý thuyết từ bất kỳ một cây chọn lọc ưu việt nào đều có thể tạo ra một quần thể với độ đồng đều cao, số lượng không hạn chế.

– Nâng cao chất lượng giống do tạo được các giống sạch bệnh, loại bỏ được các nguồn vi khuẩn, virus, nấm bệnh. Trong công tác nhân giống, vấn đề được quan tâm hàng đầu là số lượng và chất lượng giống. Bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta đã tạo được những giống cây hoàn toàn sạch virus. Limasset và Cornel (1949) đã chứng minh được rằng, số lượng virus được giảm dần ở các bộ phận gần đỉnh sinh trưởng, riêng đỉnh sinh trưởng thì hoàn toàn sạch virus (Morel and Martin, 1952). Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thường kết hợp với việc xử lý nhiệt độ cao để tạo ra nguyên liệu giống sạch bệnh. Bằng cách này, ở khoai tây, virus A, X và Y đã bị loại trừ còn virus M và S được giảm đi một cách đáng kể (Kassanis, 1950; Thomson, 1956-1958; Wang and Huang, 1975).

– Nhân giống in vitro có thể nhân nhanh cây không kết hạt hoặc kết hạt kém trong những điều kiện sinh thái nhất định. Như ở cây cọ dầu, phải mất 1015 năm mới cho thu hoạch, việc chọn, tạo và nhân nhanh được một giống mới rất khó khăn. Nhưng bằng phương pháp nhân nhanh in vitro, người ta có thể cung cấp được 500000 cây con giống hệt nhau trong vòng một năm (Staritsky, 1970).

1.2.4.3. Các phương thức nhân giống vô tính in vitro

Quá trình thực hiện nhân giống in vitro tạo ra các dòng vô tính, theo Shull (1912) dòng vô tính là một nhóm cá thể có kiểu gen tương tự nhau, chúng được nhân bằng sinh sản vô tính, các dòng vô tính này sẽ được tạo ra theo các phương thức sau:

– Tái sinh cây trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng, phôi, ngọn chồi, chồi nách.

– Tái sinh cây gián tiếp thông qua giai đoạn hình thành mô sẹo.

* Tái sinh cây trực tiếp từ mẫu nuôi cấy là quá trình phát động những điểm tồn tại sẵn có trong mô nuôi cấy, phân chia và tái sinh thành cây. Các cây con này được phát sinh từ các đỉnh sinh trưởng có bộ nhiễm sắc thể 2n, hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền và duy trì được các tính trạng của cây mẹ (Hu and Xang, 1983). Tái sinh trực tiếp cũng có thể xuất phát từ những tế bào không nằm trên đỉnh sinh trưởng, đó là các đoạn thân, mảnh lá, cuống lá, mảnh hoa… Trong trường hợp này, các tế bào thường phân chia nhưng không hình thành các tế bào mô sẹo mà tạo thành các điểm sinh trưởng cao hơn ở trường hợp nói trên.

* Con đường tái sinh gián tiếp, mẫu cấy khi nuôi trong môi trường thích hợp, thường là với auxin, có thể đem lại sự gia tăng thành khối tế bào không tổ chức, đó chính là các tế bào mô sẹo. Trong nuôi cấy, sự tăng sinh này có thể được duy trì nhiều hay ít là không hạn định, chỉ cần mô sẹo được cấy chuyển sang môi trường mới theo chu kỳ. Tuy nhiên, tế bào mô sẹo khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền. Để tránh tình trạng này nên sử dụng các loại mô sẹo vừa mới phát sinh. Nuôi cấy mô sẹo có vai trò vô cùng quan trọng trong công nghệ sinh học thực vật. Tỷ lệ auxin và cytokinin trong môi trường có thể dẫn tới sự phát triển của ngọn, rễ hay phôi soma; từ đó có thể tạo thành cây hoàn chỉnh. Nuôi cấy mô sẹo cũng có thể được sử dụng để mở đầu nuôi cấy tế bào dịch huyền phù, tạo ra hạt nhân tạo.

1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy

1.3.1. Ảnh hưởng của điều kiện khử trùng mẫu cấy

Việc khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy là một ấn đề cần thiết, vì mẫu cấy ở trong tự nhiên tiếp xúc với môi trường xung quanh nên mang rất nhiều vi khuẩn, nấm… Nhưng, do mức độ nhiễm của mỗi loại mẫu là khác nhau và đặc điểm của từng loại mẫu cũng khác nhau nên cần có sự thử nghiệm về khử trùng mẫu cấy nhằm thu được lượng mẫu vô trùng nhiều mà tốn ít nhiên liệu ban đầu.

Khả năng tiêu diệt nấm và khuẩn của hóa chất khử trùng phụ thuộc vào nồng độ, thời gian xử lý và mức độ xâm nhập của chúng vào các ngõ ngách trên bề mặt của mô cấy.

Thời gian khử trùng là một điều kiện quan trọng, nó phụ thuộc vào từng loại dung dịch khử trùng và đặc điểm của từng loại mẫu cấy. Với hypoclorite, người ta thường khử trùng trong thời gian 15-30 phút, HgCl2 thường có thời gian ít hơn. Thời gian quá lâu, dung dịch khử trùng xâm nhập vào mẫu có thể gây chết mẫu, thời gian quá ngắn sẽ không loại bỏ hết nấm và vi khuẩn nên mẫu dễ bị nhiễm.

Sau khi khử trùng, mẫu cây được đặt vào các môi trường nuôi cấy, từ đây giai đoạn nuôi cấy in vitro bắt đầu. Thành phần của môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng quyết định tới nuôi cấy.

1.3. 2. Ảnh hưởng của các thành phần hóa học

Trong nuôi cấy in vitro, cả yếu tố hóa học và yếu tố vật lý của cây trong các bình nuôi đều phải được cung cấp đầy đủ. Môi trường dinh dưỡng phải cung cấp tất cả các ion khoáng cần thiết, nguồn chất hữu cơ bổ sung như amino acid và vitamin, nguồn cacbon cố định, và một thành phần cần cho sự sống cũng phải được cung cấp đó là nước. Các nhân tố vật lý như nhiệt độ, pH, môi trường khí, ánh sáng và áp lực thẩm thấu, cũng phải được duy trì trong giới hạn chấp nhận.

Hiện nay trên thế giới có rất nhiều môi trường được sử dụng như môi trường Murashige và Skoog (1962), môi trường Gamborg (1968), môi trường Knop (1974), môi trường Anderson, Went, Knudson, Lindemann…Trong đó môi trường MS được đánh giá là phù hợp rộng rãi nhất với nhiều loại cây trồng, bao gồm cả cây hai lá mầm và cây một lá mầm. Thông thường trong một môi trường nuôi cấy phải đảm bảo các thành phần hóa học sau:

Các nguyên tố khoáng

Tùy theo nồng độ sử dụng, các nguyên tố khoáng được chia vào hai nhóm là nguyên tố đa lượng và nguyên tố vi lượng.

* Nguyên tố đa lượng: Các nguyên tố này thường chiếm 0,1 % khối lượng khô của thực vật. Nitơ, phốt pho, kali, magiê, canxi, và lưu huỳnh là các muối vô cơ. Chúng có mặt trong các hợp chất quan trọng (diệp lục. protein, acid nucleic, acid amin…), tham gia vào các quá trình như điều chỉnh áp suất thẩm thấu tế bào, vận chuyển năng lượng trong hô hấp, quang hợp, thực hiện vai trò tín hiệu tế bào,…

* Nguyên tố vi lượng: Được cung cấp với lượng rất thấp cho thực vật sinh trưởng, phát triển và có nhiều vai trò khác nhau. Mangan, iốt, đồng, coban, bo, mo, sắt và kẽm là các nguyên tố vi lượng, ngoài ra niken và nhôm cũng được tìm thấy trong một số công thức. Nguyên tố vi lượng thường có mặt trong thành phần của một số coenzyme, vitamin; tham gia vào các phản ứng trao đổi điện tử, sinh tổng hợp diệp lục,…

Chất hữu cơ bổ sung

* Các vitamin là những chất hữu cơ tham gia vào cấu trúc enzyme và cofactor trong nhiều phản ứng sinh hóa (Vũ Văn Vụ, 2006). Các loại vitamin B1, B6, PP và myoinositol là cần thiết cho nuôi cấy tế bào thực vật in vitro. Tuy nhiên, vì lý do lịch sử các loại vitamin khác nhau cũng được thêm vào để nuôi cấy.

* Các amino acid có vai trò quan trọng trong việc phát sinh hình thái, amino acid, aLanine, glutamic acid, glutamine và proline cũng được sử dụng nhưng trong nhiều trường hợp là không cần thiết.

Nguồn cacbon

Các mô và tế bào thực vật nuôi cấy nói chung, không thể tự quang hợp hoặc quang hợp yếu do thiếu clorophin và các điều kiện khác…do đó phải bổ sung thêm cacbon. Saccharose thường được sử dụng làm nguồn cacbon do đó những đặc tính như rẻ, dễ kiếm, đồng hóa triệt để và tương đối ổn định. Ngoài ra, các loại đường khác như glucose, maltose, galactose và sorbitol cũng có thể được sử dụng và trong những trường hợp đặc biệt có thể cung cấp tốt hơn đường saccharose.

Đường vừa là nguồn cacbon cung cấp cho mẫu nuôi cấy, đồng thời còn tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu của môi trường. Đường đóng góp khoảng 50-70 % vào khả năng thẩm thấu của môi trường (Trigiano and Gray, 2000). Thông thường đường saccharose được sử dụng ở nồng độ 0,2-0,3 %, nhưng nồng độ này có sự thay đổi ở từng đối tượng khác nhau và mục đích nuôi cấy khác nhau, có khi xuống tới 0,2 % (tạo dòng), có khi tăng lên đến 12 % (gây cảm ứng stress nước).

Sự hình thành rễ đòi hỏi một lượng đường được cung cấp từ quang hợp hoặc ngoại sinh. Theo George (1993) hầu hết các loại thực vật khi ra rễ thích hợp với lượng đường 20-30 g/lít. Tuy nhiên, cũng có loài yêu cầu nguồn carbohydrate ngoại sinh cao hơn. Ví dụ theo Sharma (1993) cây Gentiana kurroo chỉ có thể ra rễ tốt khi bổ sung 60 g/lít saccharose trong môi trường.

Thí nghiệm áp dụng phương pháp quang tự dưỡng cho thấy các cây in vitro đã phát triển tốt trên môi trường không có đường và vitamin, độ thoáng khí cao. Tỷ lệ nhiễm nấm giảm đáng kể. Cây có diện tích lá lớn hơn và sự đóng mở của lá theo quy luật tự nhiên ngay khi gặp điều kiện thay đổi của môi trường. Trong khi đó cây nuôi cấy theo điều kiện truyền thống (có đường và vitamin) có diện tích lá nhỏ, khí khổng luôn luôn ở trạng thái mở trong nhiều giờ khi chuyển từ điều kiện in vitro ra vườn ươm. Tỷ lệ sống 95-100 % sau một tháng ở vườn ươm đối với cây nuôi cấy trên môi trường không có đường, trái lại chỉ từ 70-80 % theo phương pháp truyền thống (Nguyễn Thị Quỳnh và cộng sự, 2005).

Chất điều tiết sinh trưởng

Chất điều tiết sinh trưởng thực vật là thành phần môi trường khắt khe trong việc xác định con đường phát triển của tế bào thực vật. Các chất điều tiết sinh trưởng được sử dụng thông thường là các hormome thực vật hoặc các chất tổng hợp tương tự chúng, phổ biến là auxin và cytokinin, gibberellins, abscisic acid, ethylene. Trong đó auxin và cytokinin là hai nhóm được sử dụng phổ biến nhất.

* Nhóm auxin gồm một số hợp chất có chứa nhân idol trong phân tử. Trong nuôi cấy in vitro, auxin thúc đẩy sinh trưởng của mẫu do hoạt hóa sự phân chia và giãn nở của tế bào, kích thích các quá trình tổng hợp và trao đổi chất, tham gia điều chỉnh sự phân hóa của rễ, chồi…(Bhojwani and Razdan, 1983).

Các auxin được sử dụng với nồng độ thấp từ 10-6 – 10-1 M tùy theo từng chất, mục đích và đối tượng nghiên cứu. Hàm lượng auxin thấp sẽ kích thích sự phân hóa rễ, hàm lượng cao kích thích hình thành mô sẹo.

Auxin được chia thành hai nhóm có nguồn gốc khác nhau: trong các auxin tự nhiên, quan trọng nhất là IAA. Nhưng IAA chỉ được dùng trong một số môi trường nuôi cấy do có đặc tính không ổn định với nhiệt độ và ánh sáng. Vì vậy, các amino acid kết hợp với IAA ổn định hơn được sử dụng phổ biến hơn làm giảm bớt liên kết khi sử dụng IAA. Nhóm auxin tổng hợp tương tự IAA được sử dụng rộng rãi hơn trong các môi trường nuôi cấy như 2,4-D, IBA. NAA.

* Cytokinin kích thích sự phân chia và ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của tế bào, cảm ứng hình thành chồi phụ và loại bỏ ưu thế ngọn (Nguyễn Như Khanh, 2002). Trong nuôi cấy mô thực vật cytokinin được dùng để kích thích sự phát sinh chồi, sử dụng kết hợp với auxin kích thích phân chia tế bào. Nồng độ cytokinin cao kìm hãm sự hình thành và phát triển của rễ (Narayaswamy, 1994). Trong các cytokinin tự nhiên có hai nhóm được sử dụng trong môi trường nuôi cấy, đó là zeatin và 2iP (2-isopentyl adenine). Nhưng chúng không được dùng phổ biến vì rất đắt (đặc biệt là zeatin) và không ổn định. Các chất tổng hợp tương tự như kinetin và BAP được sử dụng phổ biến hơn. Các chất hóa học không có based purin và thay thế bằng phenylureas, cũng được sử dụng như cytokinin trong môi trường nuôi cấy tế bào thực vật.

Trong cây có sự cân bằng nội hoocmone (Vũ Văn Vụ, 2007). Do vậy, khi sử dụng các chất điều tiết sinh trưởng trong nuôi cấy cần đặc biệt lưu ý để sử dụng nồng độ thích hợp đạt hiệu quả cao. Nhiều tác giả đã tổng kết, tỷ lệ auxin/cytokinin nếu nghiêng về phía auxin sẽ kích thích hình thành rễ; nghiêng về phía cytokinin sẽ thúc đẩy hình thành chồi; ở tỷ lệ trung gian sẽ hình thành mô sẹo.

Than hoạt tính

Than hoạt tính ban đẫu được bỏ sung vào môi trường nuôi cấy để cố gắng mô phỏng điều kiện trồng trọt, sau đó nó được sử dụng rộng rãi trong nhiều môi trường nuôi cấy. Nhiều nghiên cứu cho thấy tác dụng của than hoạt tính trong môi trường nuôi cấy mô thực vật. Đó là: sự hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol, các sản phẩm trao đổi thứ cấp, ảnh hưởng tới pH, xúc tác bẻ gãy đường saccharose trong khử trùng (S.C. Van Winkle et al, 1995). Ngoài ra than cũng hút các chất hữu cơ như phytohormone, vitamin, sắt, kẽm, … (Nissen & Sutter, 1990).

Điều tra tác dụng của than hoạt tính, sự khử trùng, và môi trường nuôi cấy trong thủy phân đường cho thấy, sự thủy phân của đường trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào cả ion H+ và sự khử trùng và thành phần than hoạt tính. Sau khử trùng, ở môi trường MS + 5 % saccharose bổ sung than hoạt tính cho tỷ lệ đường thủy phân là 70 %, tỷ lệ tương ứng ở môi trường Gamborg là 56 %, còn ở môi trường không có than hoạt tính là 20 % (Pan and Staden, 1999).

Như vậy than hoạt tính có ảnh hưởng rõ ràng tới môi trường nuôi cấy, nhiều nghiên cứu đã cho thấy tác dụng kích thích của mô in vitro như kích thích tạo củ của hoa Lili (Nhut et al, 2001), tác dụng hình thành rễ ở Pawlownia (Lê Thị Kim Đào, 2001)…

Các chất hữu cơ bổ sung

Ngoài các thành phần dinh dưỡng bắt buộc kể trên trong môi trường nuôi cấy mô tế bà thực vật in vitro, người ta còn bổ sung thêm một số thành phần hỗn hợp tự nhiên khác như nước dừa, dịch chiết nấm men, nước ép cà chua, khoai tây, chuối… Các thành phần này thường chứa nguồn dinh dưỡng và chất điều hòa sinh trưởng đa dạng như amino acid, đường, vitamin, nucleic acid, auxin, cytokinin.

Nước dừa là thành phần khá phổ biến trong nhiều môi trường nuôi cấy. Tất cả phân tích thành phần của nước dừa từ non tới già của Tulecke et al.,(1961) cho thấy trong nước dừa có: amino acid, acid hữu cơ, đường, RNA, DNA, Inositol, auxin, cytokinin,… Hàm lượng sử dụng của nước dừa từ 10-20 %.

Tác nhân làm đặc môi trường

Tùy thuộc vào loại sinh trưởng, môi trường nuôi cấy cần được sử dụng ở dạng lỏng hoặc đặc, nhiều loại môi trường nuôi cấy đòi hỏi tế bào hoặc mô thực vật phải sinh trưởng trên bề mặt, agar là tác nhân làm đặc môi trường được sử dụng phổ biến nhất. Agar được sản xuất từ tảo biển, loại tinh khiết hay agarose có thể cũng được sử dụng, nhưng có thể khác nhau về độ đặc.

1.3.3. Ảnh hưởng của các yếu tố vật lý

Các yếu tố vật lý chính là ánh sáng, nhiệt độ, độ pH, trạng thái môi trường,…

Nhiệt độ trong phòng nuôi cấy mô thường được điều chỉnh ổn định từ 220C đến 250C. Tuy nhiên tùy từng loại nuôi cấy và đối tượng nuôi cấy mà có sự điều chỉnh nhiệt độ phù hợp. Theo nhiều nghiên cứu trong nuôi cấy mô sẹo, huyền phù tế bào với mục đích sản xuất các hợp chất thứ sinh thì sự điều chỉnh nhiệt độ rất có ý nghĩa, cảm ứng cho tế bào sinh trưởng, phân chia và tiết các hợp chất thứ sinh. Nhiệt độ còn ảnh hưởng tới nuôi cấy thông qua tác đông tới cấu trúc của các chất điều hòa sinh trưởng như IAA, GA3,… pH môi trường pH của môi trường cũng là một yếu tố rất quan trọng, ảnh hưởng tới trạng thái lý hóa của các chất trong môi trường, do đó ảnh hưởng tới khả năng điện ly của các muối, sự thủy phân hóa các chất… Thông thường pH được điều chỉnh ở mức 5,5 – 5,8.

Sự phát triển của mô có thể bị thay đổi hoàn toàn nếu chúng nuôi cấy trên một môi trường đặc, lỏng hoặc nửa lỏng. Các mô nuôi cấy thường sinh trưởng tốt hơn trong môi trường lỏng, tuy nhiên môi trường lỏng cũng gây ra hiện tượng thủy tinh hóa, các mô nuôi cấy bị mọng nước gây khó khăn cho cấy chuyển và ra cây.

1.3.4. Ảnh hưởng của điều kiện ra cây

Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình sản xuất một cây giống in vitro. Mục đích của giai đoạn này nhằm đưa cây giống in vitro trong phòng nuôi ra ngoài tự nhiên; huấn luyện cây thích nghi với các điều kiện nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng tự nhiên và chuyển từ chế độ dị dưỡng sang chế độ tự dưỡng.

Mỗi loài cây có đặc điểm khác nhau, do đó để đạt tỷ lệ cây sống cao cần nghiên cứu để tìm giá thể phù hợp cho cây. Giá thể trồng cây có thể là cát, đất mùn hoặc các hỗn hợp nhân tạo không chứa đất, mùn cưa và bọt biển…

Cây nuôi cấy in vitro có đặc điểm là các khí khổng luôn mở. Vì vậy, khi chuyển cây ra vườn ươm, cây thường bị mất nước rất nhanh, do đó cần phải che phủ cẩn thận và cung cấp đủ độ ẩm cho cây bằng cách phun sương. Cần cung cấp cho cây lượng nước vừa đủ, lượng nước quá ít hoặc quá nhiều đều có ảnh hưởng không tốt cho cây.

Ngoài ra, ở giai đoạn đầu đưa ra ngoài vườn ươm, bộ rễ của cây nuôi cấy in vitro thường chưa có khả năng hấp thụ các chất ding dưỡng từ giá thể. Để tăng chất lượng của cây giống, có thể sử dụng các dung dịch dinh dưỡng để tưới cho cây.

1.4. Quy trình sản xuất cây cấy mô

Theo Debergh (1991) thì quy trình nhân giống được chia làm 5 giai đoạn: a) Lấy mẫu và xử lý mẫu

Đây là giai đoạn đầu tiên trong quy trình, cần đặc biệt chú ý vì những đặc tính của mẫu cấy sẽ được duy trì và nhân lên ở tất cả các cây giống sau này. Cần chọn lọc cây mẹ ưu việt, khỏe, có giá trị kinh tế cao; trên cây mẹ tiến hành chọn cơ quan, mô để lấy mẫu, thường là chồi non, đoạn thân có chồi ngủ, hoa non, lá non…

Khả năng nhiễm bệnh của mẫu phụ thuộc vào cách lấy mẫu, xử lý mẫu và điều kiện khử trùng. Mỗi loài cây có ngưỡng nhiệt độ và độ ẩm phù hợp khi bảo quản và xử lý mẫu. Với các cây cận nhiệt đới và nhiệt đới thì nhiệt độ 250C, độ ẩm 75 % là điều kiện giữ mẫu thích hợp, tỷ lệ nhiễm bệnh thấp (Deborgh and Zimmerman, 1991).

b) Tái sinh mẫu nuôi cấy

Mục đích của giai đoạn này là tái sinh các cơ quan từ mẫu nuôi cấy. Khả năng thành công của nuôi cấy mô tế bào thực vật phụ thuộc vào trạng thái tuổi của tế bào mẫu nuôi cấy, càng gần trạng thái phôi sinh thì khả năng tái sinh càng lớn. Sau một thời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào hoặc cơ quan (chồi, cụm chồi, rễ) hoặc các phôi vô tính có đặc tính gần như phôi hữu tính.

c) Nhân nhanh chồi

Cần tạo ra tốc độ nhân nhanh cao nhất trong điều kiện nuôi cấy, vì vậy thành phần và điều kiện môi trường phải được tối ưu nhằm đạt được mục tiêu nhân nhanh. Môi trường ở giai đoạn này cần bổ sung các hormone sinh trưởng (cytokinin, auxin), tăng thời gian chiếu sáng lên từ 16 giờ/ ngày, cường độ ánh sáng tối thiểu là 1000 lux, nhiệt độ thích hợp là từ 20 – 300C.

Quy trình cấy chuyển nhân nhanh chồi thông thường diễn ra trong khoảng 1-2 tháng tùy từng loại cây. Tỷ lệ nhân nhanh sau mỗi lần cấy chuyển đạt khoảng 2 – 8 lần/ 1 lần cấy chuyển. Giai đoạn nhân nhanh chồi từ một vài chồi ban đầu không nên kéo dài quá lâu để tránh biến dị soma. Ví dụ từ một chồi cây chuối chọn lọc ban đầu người ta chỉ nên nhân lên khoảng 2000 – 3000 chồi cây sau 7 – 8 lần cấy chuyển, đối với các cây khác như mía, cúc, hoa phong Lan sau một năm có thể nhân được trên 1 triệu chồi từ một cây mẹ ban đầu.

d) Tái sinh rễ

Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát rễ tự sinh, nhưng thông thường các chồi này phải được cấy chuyển sang một môi trường khác để kích thích tạo rễ. Môi trường tái sinh rễ thường được bổ sung auxin (NAA, IBA, 2,4-D) ở liều lượng thích hợp. Tuy nhiên, một số cây như chuối thì sự hình thành rễ tốt hơn ở môi trường không có chất sinh trưởng.

e) Chuyển cây ra vườn ươm

Các cây nuôi cấy in vitro sau khi đã tái sinh hoàn chỉnh sẽ được chuyển ra ngoài vườn ươm. Cây chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng. Vì vậy, cần huấn luyện cho cây thích nghi với sự thay đổi của môi trường.

1.5. Tình hình nghiên cứu cây lan Kim tuyến

1.5.1.Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Chi lan Kim tuyến (Anoectochilus) đã được nghiên cứu chủ yếu ở Trung Quốc một cách toàn diện cả về đặc điểm hình thái, kỹ thuật nhân giống, khả năng trồng, thành phần hóa học và công dụng phòng, chữa bệnh (Lai Wan Yu, Lai Wan Nian, 2005).

Chow và CS (1982) đã nghiên cứu về nguồn vật liệu sử dụng cho nhân sinh khối in vitro loài Anoectochilus formosanus rất đa dạng. Năm 1987, Liu và CS đã chọn chồi đỉnh để nuôi cấy mô. Cũng năm 1987, Ho và CS, năm 1992, Lee và CS đã sử dụng phôi hạt để làm nguồn vật liệu nuôi cấy.

Năm 2001, các tác giả Yih-juh Shiau, Abhay Psagare, Uei-Chin Chen, Shu-Ru Yang và Hsin-Sheng Tsay đã nghiên cứu thành công loài Lan Kim tuyến (Anoectochilus formosanus Hayata) từ hạt với công thức môi trường vào mẫu là: 1/2MS + 0,2% than hoạt tính + 8% dịch chiết chuối. Môi trường được sử dụng để nhân nhanh chồi là: 1/2MS + 0,2% than hoạt tính + 8% dịch chiết chuối + 2mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA.

Năm 2002, Tsay và CS đã cắt các mắt đốt thân lấy từ cây Anoectochilus Formosanus Hayata 2 năm tuổi cấy vào môi trường MS lỏng dung tích 500 ml + 2mg/l BAP + 0,5mg/l NAA + 2% than hoạt tính.

1.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước

Hiện nay, lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) được xếp trong nhóm IA trong sách đỏ Việt Nam, cần bảo tồn các quần thể nhỏ còn sót lại ở các Vườn Quốc gia và Khu Bảo tồn thiên nhiên, cũng như cần nghiên cứu nhân giống tạo hàng hóa xuất khẩu và bảo vệ nguồn gen. Ở Việt Nam do bị người dân thu hái tự phát để bán làm thuốc nên loài lan Kim tuyến đang bị đe dọa nghiêm trọng, rất có thể sẽ bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên nếu chúng ta không có biện pháp bảo tồn hữu hiệu. Mặc dù vậy cho đến nay, ở nước ta vẫn chưa có bất kì công trình nghiên cứu nào về kỹ thuật nhân giống, gây trồng cho loài cây quý này được công bố. Do vậy, có thể nói việc nghiên cứu nhân nhanh loài lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume bằng phương pháp nhân giống in vitro vừa có ý nghĩa lý luận và ý nghĩa về mặt thực tiễn.

Những năm gần đây, đã có một số đề tài nghiên cứu về đặc điểm hình thái, phân bố và kỹ thuật nhân giống in vitro loài lan Kim tuyến này như:

Năm 2004, Nguyễn Văn Kiệt cũng đã đưa ra quy trình nhân giống in vitro thành công cho loài lan Kim tuyến Anoectochilus formosanus với vật liệu ban đầu là từ chồi đỉnh tại đại học Chungbuk, Hàn Quốc. Môi trường tạo vật liệu khởi đầu là H3 (Hyponex: 6,5N-4,5P-19K 1g/l + 20N-20P-20K 1g/l) + 2g/l peptone. Môi trường nhân nhanh là: H3 + 1mg/l BAP (hoặc 1-2mg/l TDZ) + 1% than hoạt tính.

Năm 2010, Phùng Văn Phê, Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nguyễn Trung Thành. Đã đạt được những kết quả bước đầu trong nhân nhanh chồi in vitro loài Lan kim tuyến – Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl.

Năm 2010,Phan Ngọc Khoa, Trường Đại học Khoa học Huế đã nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến nhân giống in vitro lan Kim tuyến.”.

Các tác giả trên đã bước đầu tiến hành thăm dò ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng và bước đầu tiến hành nhân giống thử nghiệm lan Kim tuyến nhưng chưa tác giả nào đưa ra quy trình hoàn chỉnh để nhân giống loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume). Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi đặc biệt chú trọng đến nghiên cứu nhân nhanh và quy trình ra cây hoàn chỉnh cho loài thảo dược quý hiếm này.

II. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Cây lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume)

Mẫu chồi được tái sinh từ thân ngầm, thân khí sinh của cây lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) được thu từ Vườn quốc gia Tam Đảo, Vĩnh Phúc.

2.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

+ Địa điểm: Thí nghiệm được tiến hành tại Viện Sinh học Nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội và Phòng công nghệ tế bào Thực vật, Trung tâm Nghiên cứu Khoa học Sự sống, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên.

+ Thời gian: từ tháng 11/2011 – 12/2012

2.2. Mục tiêu nghiên cứu

– Xác định điều kiện khử trùng mẫu nuôi cấy thích hợp, tìm ra các môi trường thích hợp cho việc nhân nhanh in vitro.

– Xác định điều kiện ra cây và bước đầu đưa cây ra vườn ươm.

2.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

2.3.1. Ý nghĩa khoa học

– Đề tài sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học về loài lan (Anoectochilus setaceus Blume), chi Lan Kim tuyến.

– Cung cấp những cơ sở khoa học về quy trình nhân giống in vitro lan Anoectochilus setaceus Blume.

– Các kết quả nghiên cứu sẽ bổ sung thêm tài liệu khoa học phục vụ cho công tác giảng dạy, nghiên cứu khoa học về loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume).

2.3.2. Ý nghĩa thực tiễn

– Đề xuất được quy trình nhân giống in vitro cho lan Anoectochilus setaceus Blume.

– Góp phần bảo tồn, thúc đẩy sản xuất cây Anoectochilus setaceu Blume như một nghề trồng lan mang lại giá trị kinh tế cao.

2.4. Nội dung nghiên cứu

2.4.1. Nghiên cứu xác định chất khử trùng, thời gian khử trùng và cơ quan vào mẫu thích hợp.

2.4.2. Nghiên cứu xác định môi trường khởi động và nhân nhanh thích hợp.

+ Xác định môi trường nền thích hợp.

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của các nhóm chất điều tiết sinh trưởng đến sự phát sinh hình thành và hệ số nhân.

2.4.3. Nghiên cứu môi trường thích hợp cho sự ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh.

2.4.4. Nghiên cứu điều kiện ra cây thích hợp cho loài lan Kim tuyến (Anoectochilus Setaceus Blume).

2.5. Phương pháp nghiên cứu

Điều kiện nuôi cấy

– Mẫu được cấy trên môi trường đã được khử trùng ở 1,4 atm, 1210C

– pH của môi trường là: 5,4.

– Nhiệt độ phòng nuôi: 25±20C

– Cường độ ánh sáng: 2000 lux

– Thời gian chiếu sáng: 16 giờ chiếu sáng/ngày đêm

2.5.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm

A. Xác định các phương pháp khử trùng tạo mẫu sạch

Thí nghiệm 1. Xác định chất khử trùng thích hợp

Chồi và mắt đốt ngang thân cây lan Kim tuyến sau thu hái, được rửa sạch bằng xà phòng, sau đó được thử nghiệm khử trùng bằng cồn 70o và H2O2 0,01% trong các khoảng thời gian khác nhau. Sau đó được rửa sạch lại nhiều lần bằng nước cất vô trùng rồi cấy vào môi trường vào mẫu là: 1/2MS + 0.2% than hoạt tính + 0,8% dịch chiết chuối. Thí nghiệm được tiến hành với các công thức khử trùng:

CT1: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s. CT2: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 20s.

CT3: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 30s.

CT4: Ngâm trong NaClO 2% trong 5 phút (300s).

CT5: Ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút (600s).

CT6: Ngâm trong NaClO 2% trong 15 phút (900s).

CT7: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s rồi ngâm trong NaClO 2% trong 5 phút.

CT8: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s rồi ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút.

CT9: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s rồi ngâm trong NaClO 2% trong 15 phút.

Thí nghiệm 2. Xác định cơ quan vào mẫu thích hợp nhất cho việc tạo mẫu sạch

Các cơ quan khác nhau là: Chồi đỉnh, chồi nách, mắt đốt ngang thân được khử trùng bằng công thức khử trùng hiệu quả nhất (rút ra ở Thí nghiệm 1).

Theo dõi số mẫu sống, số mẫu bị nhiễm.

Thí nghiệm 3. Xác định cơ quan vào mẫu thích hợp đến hệ số nhân chồi in vitro

Cấy mẫu vào môi trường nhân cơ bản là MS + 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin + 100 ml/l ND + 100 g/l dịch chiết khoai tây + 20 g/l sucrose + 7 g/l agar.

Mỗi loại vật liệu (chồi đỉnh, chồi nách, mắt đốt ngang thân) được bố trí 3 lần lặp lại, mỗi lần 7 mẫu.

B. Xác định môi trường khởi động và nhân nhanh thích hợp

Khi các mẫu sạch bệnh được chuyển sang môi trường nhân nhanh. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện nuôi trồng khác nhau đối với quá trình nhân nhanh. Mỗi công thức được bố trí 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 7 mẫu, mỗi công thức là 21 mẫu.

Thí nghiệm 4. Xác định môi trường nền thích hợp cho nuôi cấy mô cây Lan Kim tuyến (A. setaceus)

Thí nghiệm được tiến hành dựa trên ba môi trường nền được sử dụng phổ biến hiện nay là MS, Knudson C và Knudson C cải tiến (Knud*). Các công thức được tiến hành trên nền môi trường chung là:

Nền môi trường = 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar.

CT1: Knud* + Nền môi trường

CT2: MS + Nền môi trường

CT3: Knudson C + Nền môi trường

Thí nghiệm 5. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất cytokinin (BAP và kinetin) đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân

Sau khi tìm ra môi trường nền thích hợp trong thí nghiệm 4, thí nghiệm 5 tiếp tục tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất cytokinin tới khả năng phát sinh chồi lan Kim tuyến. Trong đó, môi trường nền sử dụng chung cho các công thức là:

Nền môi trường = Môi trường nền (TNo4) + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar.

CT1: ĐC

CT2: Nền môi trường + 0,1mg/l BAP

CT3: Nền môi trường + 0,5mg/l BAP

CT4: Nền môi trường + 1,0 mg/l BAP

CT5: Nền môi trường + 2,0 mg/l BAP

CT6: Nền môi trường + 0,1mg/l Kinetin

CT7: Nền môi trường + 0,5mg/l Kinetin

CT8: Nền môi trường + 1,0 mg/l Kinetin

CT9: Nền môi trường + 2,0 mg/l Kinetin

Thí nghiệm 6. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất Auxin (IBA và α-NAA) đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân

Thí nghiệm tiếp tục được tiến hành trên nền môi trường trên và thăm dò ảnh hưởng của auxin với các nồng độ khác nhau

Nền môi trường = Môi trường nền (TNo4) + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar.

CT1: ĐC

CT2: Nền môi trường +0,5 mg/l IBA

CT3: Nền môi trường +1,0 mg/l IBA

CT4: Nền môi trường +1,5 mg/l IBA

CT5: Nền môi trường +2,0 mg/l IBA

CT6: Nền môi trường +3,0 mg/l IBA

CT7: Nền môi trường +0,5 mg/l α-NAA

CT8: Nền môi trường +1,0 mg/l α-NAA

CT9: Nền môi trường +1,5 mg/l α-NAA

CT10: Nền môi trường +2,0 mg/l α-NAA

CT11: Nền môi trường +3,0 mg/l α-NAA

Thí nghiệm 7. Nghiên cứu ảnh hưởng của sự phối hợp 2 nhóm chất là cytokinin và auxin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân

Qua các kết quả thực nghiệm cho thấy, nồng độ BAP và Kinetin khi sử dụng phối hợp là 0,5mg/l và 0,3mg/l do đó thí nghiệm sẽ tiếp tục thăm dò ảnh hưởng của sự phối hợp 2 nhóm chất trên dựa trên nền môi trường:

Nền môi trường = Môi trường nền (TNo4) + 0,5mg/l BAP + 0,3mg/l Kinetin + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar.

CT1: Nền môi trường +0,1mg/l IBA

CT2: Nền môi trường +0,3mg/l IBA

CT3: Nền môi trường +0,5mg/l IBA

CT4: Nền môi trường + 0,1mg/l α-NAA

CT 5: Nền môi trường +0,3mg/l α-NAA

CT6: Nền môi trường +0,5mg/l α-NAA

C. Nghiên cứu ra rễ tạo cây hoàn chỉnh

Khi các chồi lan Kim tuyến có chiều cao 3-4 cm, có 3-4 lá được cấy chuyển sang môi trường ra rễ. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền (không có chất điều tiết sinh trưởng) và than hoạt tính đến sự ra rễ. Mỗi công thức được bố trí 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 6 mẫu, mỗi công thức là 18 mẫu.

Thí nghiệm 8. Ảnh hưởng của môi trường nền (môi trường dinh dưỡng cơ bản) đến sự ra rễ

CT1: MS + 20g/l Sucrose + 7g/l agar

CT2: MS/2 + 20g/l Sucrose + 7g/l agar

CT3: Knud* + 20g/l Sucrose + 7g/l agar

CT4: Knud*/2 + 20g/l Sucrose + 7g/l agar

Thí nghiệm 9. Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến sự ra rễ

Các thí nghiệm được tiến hàn trên nền môi trường nghèo dinh dưỡng

CT1= ĐC= Nền = MS + 20g/l Sucrose + 0% than hoạt tính + 7g/l agar

CT2: Nền + 1% than hoạt tính

CT3: Nền + 3% than hoạt tính

CT4: Nền + 5% than hoạt tính

D. Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện chăm sóc tới khả năng sinh trưởng của loài lan Kim tuyến (Anoectochilus Setaceus Blume) in vitro ngoài vườn ươm.

Cây cao 3-4cm, mọc 3-4 lá và có 3-4 rễ đủ tiêu chuẩn đưa ra ngoài vườn ươm. Cây in vitro cho ra khỏi môi trường tạo rễ, rửa sạch agar bám trên rễ, rồi trồng trong giá thể ngoài vườn ươm.

* Cách bố trí thí nghiệm:

– Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, mỗi công thức lặp lại 3 lần, mỗi chậu trồng 3 cây.

– Định kì theo dõi: 7 ngày/1lần, chúng tôi đo chiều cao cây, đến rễ lá, số nhánh trong mỗi lần đo định kì.

– Số cây theo dõi

– Cách tưới: Phun mù dưới dạng sương mù vào lúc sáng sớm

Thí nghiệm 10. Nghiên cứu giá thể phù hợp cho việc ra cây loài Lan Kim tuyến (Anoectochilus Setaceus Blume) in vitro Giá thể:

CT 1: Giá thể 100% dớn

CT 2: Giá thể 50% Dớn + 50% xơ dừa

CT 3: Giá thể 100% xơ dừa

CT 4: Giá thể 100% bột dừa

Thí nghiệm 11. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian huấn luyện cây trong bình đến tỷ lệ sống của lan Kim tuyến khi trồng lên giá thể

Thí nghiệm được bố trí với thời gian huấn luyện cây khác nhau:

ĐC: 0 ngày CT1: 4 ngày CT2: 8 Ngày

CT3: 12 Ngày CT4: 16 ngày

Cây sau khi huấn luyện sẽ được trồng vào giá thể là dớn và xơ dữa trộn lẫn trong nhà lưới được che kín bằng lưới đen.

Thí nghiệm 12. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian che phủ ở nhà lưới đến tỷ lệ sống của lan Kim tuyến khi trồng lên giá thể

Cây Lan in vitro sau khi huấn luyện, đủ tiêu chuẩn đem ra trồng, sẽ được rửa sạch thạch và trồng lên giá thể ở nhà lưới. Luống cây sau khi trồng sẽ được che kín bằng nilon trắng, phía trên che bằng lưới đen có độ che sáng 50%. Thí nghiệm được bố trí với các khoảng thời gian che kín nilon khác nhau:

ĐC: 0 ngày CT1: 5 ngày CT2: 10 Ngày CT3: 15 Ngày

2.5.2. Phương pháp đánh giá kết quả và xử lý số liệu

Các chỉ tiêu theo dõi

12. Chỉ tiêu thu thập: Tỷ lệ sống của cây con, đặc điểm của cây con

13. Thời gian thu thập: cứ 1 tuần quan sát và ghi số liệu 1 lần.

III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu sạch và xác định cơ quan vào mẫu phù hợp cho việc nhân nhanh in vitro

Nhân giống in vitro có hệ số nhân giống cao, cây con tạo ra đồng nhất và sạch bệnh. Muốn vậy, trong bất kỳ quy trình nhân giống nào thì việc chọn vật liệu khởi đầu và việc tạo mẫu sạch in vitro chính là điều kiện tiên quyết để quyết định thành công của toàn bộ quá trình. Bởi vì đây chính là giai đoạn cung cấp nguồn mẫu sạch cho các giai đoạn tiếp theo của quá trình nhân giống.

Mẫu sạch in vitro được tạo ra từ nhiều nguồn, có thể là từ các bộ phận sinh dưỡng (thân, lá, rễ, phát hoa…) hoặc từ cơ quan sinh sản (quả). Trong nghiên cứu này các loại vật liệu đã sử dụng là thân khí sinh, thân ngầm được cắt đoạn và cho vào mẫu để lựa chọn loại mẫu cấy phù hợp.

3.1.1. Xác định chất khử trùng thích hợp

Khử trùng mẫu là khâu quan trọng nhằm loại bỏ các nguồn nấm, vi khuẩn, virus khỏi mẫu, thu được nguồn mẫu vô trùng cho các nghiên cứu tiếp theo. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới kết quả khử trùng như phương pháp lấy mẫu, thời điểm lấy mẫu, thời gian khử trùng, hóa chất khử trùng… Trong thí nghiệm này hóa chất được sử dụng là cồn 70⁰ và NaClO 2% bố trí ở các khoảng thời gian khác nhau. Sau khi khử trùng mẫu được cấy vào môi trường vào mẫu, sau một khoảng thời gian nhất định, thường là từ sau 2-3 tuần những mẫu sạch bắt đầu tái sinh. Đánh giá khả năng tái sinh là bước tiếp theo để tìm ra công thức khử trùng tốt nhất. Kết quả thu được sau 15 ngày thể hiện ở Bảng 3.1.

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đến hiệu quả tạo mẫu sạch cây lan Kim tuyến (kết quả theo dõi sau 15 ngày)

    Với chất khử trùng là cồn 70⁰ :

Cồn 700 là chất có tác dụng sát khuẩn và phá hủy thành cellulozo của tế bào thực vật nên khi kéo dài thời gian khử trùng thì tỷ lệ sống của mẫu giảm đồng thời tỷ lệ nhiễm cũng giảm. Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, thời gian khử trùng với cồn 70⁰ trong 10s (CT1) cho tỷ lệ mẫu sống cao nhất (47,62%) do thời gian ngắn thành tế bào ít bị phá hủy là nhưng tỷ lệ nhiễm cũng cao (52,38%) do chưa đủ để dung dịch khử trùng giết chết các nguồn bệnh. Khi tăng thời gian khử trùng lên 20s (CT2) thì tỷ lệ sống và tỷ lệ nhiễm giảm là 28,57% và 47,62%. Tiếp tục tăng thời gian khử trùng lên 30s (CT3) thì tỷ lệ sống tiếp tục giảm còn 14,29% và 38,1%.

    Với chất khử trùng là NaClO 2%

NaClO 2% là hóa chất có tính sát khuẩn cao nên khi tăng thời gian khử trùng thì tỷ lệ nhiễm sẽ giảm nhưng nếu thời gian khử trùng lâu thì dung dịch có thể xâm nhập vào bên trong gây độc với mẫu. Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, khi khử trùng trong thời gian 5 phút (CT4) thì tỷ lệ nhiếm cao (23,81%) do thời gian chưa đủ để diệt các nguồn bệnh. Khi tăng thời gian khử trùng lên 10 phút (CT5) thì tỷ lệ nhiễm thấp nhất (9,52%), tỷ lệ sống cao (57,14%). Tiếp tục tăng thời gian khử trùng lên tới 15 phút(CT6) dung dịch đã gây độc cho mẫu nên tỷ lệ sống thấp hơn (33,33%), tỷ lệ nhiễm tăng lên. Như vậy, thời gian khử trùng bằng NaClO 2% tốt nhất là trong 10 phút, cho tỷ lệ sống cao và tỷ lệ nhiễm thấp. Khử trùng bằng phương pháp kết hợp giữa cồn 70⁰ và NaClO 2%

Khi kết hợp cả hai chất khử trùng trên với thời gian khử trùng thích hợp đã khắc phục được các nhược điểm của từng chất nên cho tỷ lệ sống cao hơn và tỷ lệ nhiễm giảm. Kết quả thí nghiệm cho thấy, phương pháp khử trùng là ngâm cồn 70⁰ trong 10s rồi ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút (CT8) cho tỷ lệ sống cao nhất đạt 90,48% và tỷ lệ nhiễm thấp (28,57%).

Như vậy, thời gian khử trùng mẫu có ảnh hưởng khá lớn tới tỷ lệ sống của mẫu cấy. Công thức khử trùng CT8 (ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s rồi ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút) là vừa đủ, vừa có khả năng tiêu diệt mầm bệnh mà lại tác động nhẹ đến thành tế bào nên cho tỷ lệ sống cao và kích thích mẫu tái sinh.

3.1.2. Xác định cơ quan vào mẫu thích hợp để tạo mẫu sạch và tăng hệ số nhân chồi in vitro

Mục tiêu đặt ra của quy trình khử trùng cho bất kỳ loài cây nào đều là tạo được tỷ lệ mẫu sạch cao đồng thời có khả năng tái sinh mạnh. Một trong các yếu tố chính ảnh hưởng đến khả năng này là bản chất vật liệu làm mẫu cấy. Mẫu cấy tiếp xúc với nước, đất như rễ thường có lượng vi sinh vật rất cao và khó loại bỏ hoàn toàn chúng khỏi nguồn mẫu. Mẫu mọng nước, có lông thường khó khử trùng hơn những mẫu không mọng nước, bề mặt nhẵn.

Trong nghiên cứu này các vật liệu được khử trùng được khử trùng theo công thức khử trùng tốt nhất suy ra từ kết quả nghiên cứu phần 3.1.1

3.1.2.1. Ảnh hưởng của loại vật liệu đến tỷ lệ tạo mẫu sạch

Qua kết quả thí nghiệm 1 cho thấy, điều kiện khử trùng hiệu quả nhất đối với loài Lan Kim tuyến là: Ngâm trong cồn 70o trong 10s sau đó ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút. Do đó, để xác định cơ quan vào mẫu phù hợp nhất thí nghiệm tiếp tục áp dụng điều kiện khử trùng trên với các vật liệu khác nhau của cây lan Kim tuyến là: Chồi đỉnh, chồi nách, mắt đốt ngang thân. Kết quả thu được sau 15 ngày được thể hiện ở Bảng 3.2.

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của loại vật liệu đến tỷ lệ tạo mẫu sạch (Kết quả thu được sau 15 ngày)

Qua kết quả nghiên cứu ở thí nghiệm này cho thấy, cơ quan vào mẫu thích hợp cho việc tạo mẫu sạch là mắt đốt ngang thân.

3.1.2.2. Ảnh hưởng của cơ quan vào mẫu đến hệ số nhân chồi in vitro

C

ơ quan vào mẫu có ảnh hưởng rõ rệt đến hệ số nhân chồi. Ở một số loài, cơ quan vào mẫu có tỷ lệ mẫu sạch bệnh cao nhất nhưng lại cho hệ số nhân chồi thấp nhất. Do đó, để đạt hiệu quả nhân nhanh chồi in vitro loài lan Kim tuyến, chúng tôi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của cơ quan vào mẫu đến hệ số nhân chồi lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume). Kết quả thí nghiệm thu được thể hiện qua Bảng 3.3.

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của cơ quan vào mẫu đến hệ số nhân chồi in vitro (kết quả theo dõi sau 8 tuần).

Phân tích phương sai một nhân tố với 3 lần lặp của tỷ lệ mẫu sạch, hệ số nhân và chiều cao chồi đều được hiệu của trung bình mỗi công thức lớn hơn

LSD0,05 chứng tỏ cơ quan vào mẫu có ảnh hưởng rõ rệt đến tỷ lệ tạo chồi, hệ số nhân và chiều cao TB chồi ở độ tin cậy 95%.

Qua kết quả ở Bảng 3.3 cho thấy, khi cấy các vật liệu là chồi đỉnh, chồi nách, mắt đốt ngang thân vào môi trường nhân nhanh phù hợp, kết quả theo dõi sau 8 tuần cho thấy mắt đốt ngang thân là cơ quan tái sinh và phát triển tốt nhất với tỷ lệ tạo mẫu là 100%, hệ số nhân 4,56 lần, chồi dài 3,2 cm. Cơ quan nhân kém nhất là chồi đỉnh với tỷ lệ tạo chồi chỉ đạt 33,33%, hệ số nhân là 2,11 lần và chiều dài chồi là 2,6 cm. Chồi nách cho tỷ lệ tạo mẫu là 44,44%, hệ số nhân 3,5 lần và chiều dài chồi 2,95 cm.

Như vậy, cơ quan vào mẫu thích hợp nhất để tăng hệ số nhân chồi in vitro lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus) là mắt đốt ngang thân.

3.2. Nghiên cứu môi trường khởi động và nhân nhanh thích hợp

Trong nuôi cấy in vitro, môi trường nuôi cấy đóng vai trò quan trọng. Vừa phải cung cấp chất dinh dưỡng cho mẫu vừa phải biệt hoá mẫu theo những hướng xác định. Do đó nghiên cứu lựa chọn môi trường nuôi cấy phù hợp nhất sẽ cho hệ số nhân cao, chất lượng chồi tốt.

3.2.1. Xác định môi trường nền thích hợp cho nuôi cấy mô Lan Kim tuyến (A. setaceus)

Những nghiên cứu về nuôi cấy Phong lan in vitro cho thấy có một số môi trường thích hợp để nuôi cấy Phong lan như: MS; môi trường Knudson C cho Cattleya, Cymbidium (Adirti, 1993), môi trường Knudson cải tiến (Knud*), môi trường Hyponex (Lou and Kako,1995; Nakano et al, 2000…), môi trường Vaccin &Went… Trong đề tài này chúng tôi nghiên cứu nuôi cấy loài Lan Kim tuyến trên ba loại môi trường cơ bản: MS, Knudson C và Knud*.

Thể chồi 4 tuần tuổi từ môi trường vào mẫu được cấy vào các môi trường khác nhau là MS, Knud*, Knudson có bổ sung thêm 20g/l sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar. Sau 8 tuần nuôi cấy ta thu được kết quả sau:

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của môi trường nền đến khả năng nhân nhanh chồi, mắt đốt lan Kim tuyến

Kết quả phân tích phương sai cho thấy, môi trường nền có ảnh hưởng tới khả năng nhân nhanh chồi, mắt đốt lan Kim tuyến.

Theo kết quả ở Bảng 3.4 thấy rằng môi trường Knud* cho số lượng chồi (3,67 chồi/mẫu) và số lá (4,12 lá/chồi) nhiều hơn ở môi trường MS (số lượng chồi 2,11 chồi/mẫu và số lá 1,55 lá/chồi) và Knudson (số lượng chồi 2,06 chồi/mẫu và số lá 2,35 lá/chồi). Đồng thời, trong môi trường Knud* thì chiều dài chồi (3,57cm) dài hơn hẳn so với hai môi trường còn lại (MS là 1,33 cm và Knudson là 2,22 cm) và chất lượng chồi cũng tốt hơn chồi mập, xanh. Như vậy, môi trường nền thích hợp nhất cho nuôi cấy mô lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus) là nuôi trường có nguồn gốc Knud*.

3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất điều hòa sinh trưởng riêng rẽ và phối hợp đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân

Chất điều hoà sinh trưởng không những là công cụ hữu ích giúp chúng ta nghiên cứu sâu hơn về sự phát sinh hình thái thực vật mà còn giúp ta chủ động định hướng cho sự phát triển của thực vật trong ống nghiệm. Đặc biệt với mục đích nhân giống tạo số lượng lớn trong thời gian ngắn thì việc sử dụng các loại chất điều tiết sinh trưởng ở nồng độ khác nhau cho tỷ lệ mẫu tái sinh lớn nhất là tất yếu.

3.2.2.1. Ảnh hưởng của nhóm chất Cytokinin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân

Cytokinin được biết đến là nhóm chất điều hòa sinh trưởng có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trưởng của chồi in vitro (Miller, 1961). Để tăng hệ số nhân giống, người ta tăng nồng độ cytokinin trong môi trường nuôi cấy ở giai đoạn tạo chồi in vitro (Nguyễn Quang Thạch, 2007). Các loại cytokinin thường được sử dụng trong nuôi cấy như: BAP, Kinetin, TDZ, Zeatin…

Trong thí nghiệm này, hai loại cytokinin là BAP và Kinetin được dùng với các nồng độ khác nhau là 0,1; 0,5; 1,0 và 2,0 mg/l trên môi trường (Knud* + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar). Kết quả thu được ở Bảng 3.5.

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nhóm chất Cytokinin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân (kết quả theo dõi sau 8 tuần)

    Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân chồi

Kết quả xử lý thống kê hàm Anova một nhân tố cho thấy, giữa các công thức có sự khác biệt rõ rệt về số lượng chồi, số đốt và chiều cao chồi ở độ tin cậy 95% và khác biệt so với đối chứng.

Theo kết quả thu được ở Bảng 3.5 cho thấy, môi trường có bổ sung 1,0 mg/l BAP cho số chồi và số đốt cao hơn nhất (5,22 chồi/mẫu và 2,93 đốt/chồi), chiều cao chồi cũng lớn nhất (3,23 cm). Ở các môi trường có nồng độ BAP khác thì thấp hơn, số lượng chồi khi sử dụng nồng độ 0,1 mg/l BAP là 2,44 chồi/mẫu, ở nồng độ 0,5 mg/l BAP là 3,94 chồi/mẫu, ở nồng độ 2,0 mg/l là 4,22 chồi/mẫu và đối chứng là 1,22 chồi/mẫu, số đốt khi sử dụng các nồng độ 0,1; 0,5; 2,0 mg/l BAP lần lượt là 2,16; 2,33; 2,35 đốt/chồi và đối chứng là 1,54 đốt/chồi. Về chất lượng chồi thì ở nồng độ 1,0 mg/l BAP cũng cho chất lượng chồi tốt nhất chồi to khỏe, xanh đậm còn ở nồng độ 0; 0,1 và 2,0 mg/l thì do nồng độ quá cao và quá thấp nên chồi nhỏ và yếu, xanh nhạt.

Như vậy, việc bổ sung BAP ở nồng độ 1,0 mg/l là thích hợp nhất cho sự phát sinh hình thái và hệ số nhân chồi lan Kim tuyến.

    Ảnh hưởng của Kinetin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân chồi

Kết quả xử lý thống kê hàm Anova một nhân tố cho thấy, giữa các công thức có sự khác biệt rõ rệt về số lượng chồi, số đốt và cả chiều cao chồi ở độ tin cậy 95% và khác biệt so với đối chứng.

Theo kết quả thu được ở Bảng 3.5 cho thấy, môi trường có bổ sung 1,0 mg/l Kinetin cũng cho số chồi và số đốt cao hơn nhất (4,91 chồi/mẫu và 2,68 đốt/chồi), chiều cao chồi cũng lớn nhất (3,23 cm). Ở các môi trường có nồng độ Kinetin khác thì thấp hơn, số lượng chồi dao động từ 2,33 – 4,22 chồi/mẫu, số đốt dao động từ 1,98 – 2,45 đốt/chồi. Về chất lượng chồi thì ở nồng độ 1,0 mg/l BAP cũng tốt nhất chồi to khỏe, xanh đậm còn ở nồng độ 0; 0,1 và 2,0 mg/l thì chồi nhỏ, xanh nhạt.

Như vậy, bổ sung Kinetin cũng ở nồng độ 1,0 mg/l là thích hợp nhất cho sự phát sinh hình thái và hệ số nhân chồi lan Kim tuyến.

3.2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA và αNAA đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân lan Kim tuyến (A. setaceus)

Tác dụng rõ nét nhất của auxin đối với sự phân hóa tế bào là khả năng phát sinh rễ đã được kiểm chứng từ năm 1934 (Went, Skoog, Thimann). Nhiều nghiên cứu đã cho thấy vai trò của IBA và αNAA tác động đến quá trình phát sinh rễ trên nhiều đối tượng nghiên cứu như cây lát hoa Côn Đảo, tram Úc… (Trần Văn Minh và Cộng sự, 2003; Nguyễn Văn Nghi và Cộng sự, 2003).

Để kiểm tra ảnh hưởng của auxin (IBA và NAA) tới sự phát sinh hình thái và hệ số nhân, thí nghiệm này được tiến hành trên môi trường Knud* và bổ sung riêng rẽ IBA và αNAA với các nồng độ khác nhau 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 3,0mg/l + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 7g/l agar. Kết quả thu được ở Bảng 3.6.

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của auxin (IBA và αNAA) tới sự phát sinh hình thái lan Kim tuyến

Sau 8 tuần nuôi cấy trong môi trường có bổ sung auxin IBA và αNAA với các dải nồng độ từ 0,5-3,0 mg/l thu được kết quả trong Bảng 3.6. Kết quả cho thấy, IBA và αNAA có hiệu quả sản sinh rễ bất định, αNAA có hiệu quả sản sinh rễ lớn hơn IBA nhưng hiệu quả sản sinh rễ không rõ ràng ở cả 2 loại phytohormon trên. Số lượng rễ và chiều dài rễ không khác biệt nhiều giữa các công thức. Trái lại, hai loại auxin này lại có hiệu quả rõ rệt trong việc sản sinh chồi bất định và đạt kết quả lớn và khác biệt hẳn giữa các công thức. Cụ thể là IBA ở nồng độ (1,5mg/l) cho 4,87 chồi/mẫu và αNAA (1,0mg/l) cho 4,55 chồi/mẫu. Lá cây có màu xanh đậm nhưng kích thước lá nhỏ hơn so với cytokinin. Trong rất nhiều các thí nghiệm và tài liệu nghiên cứu, các loại auxin như IBA, αNAA, 2,4 D, IAA được sử dụng để sản sinh rễ cho hầu hết các loại cây nhưng trong thí nghiệm này, đối với cây lan Kim tuyến (A. setaceus) IBA và αNAA không có hiệu quả sản sinh rễ bất định.

3.2.2.3.Ảnh hưởng của sự phối hợp 2 nhóm chất là auxin và cytokinin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân

Nhiều tác giả đã tổng kết rằng sự biệt hóa cơ quan thực vật in vitro là kết quả tác động qua lại giữa hai nhóm auxin và cytokinin. Tỷ lệ auxin/cytokinin cao sẽ kích thích sự ra rễ, trái lại sẽ đẩy mạnh sự biệt hóa chồi, ở tỷ lệ trung bình thì hình thành mô sẹo. Để nghiên cứu nhân nhanh nhằm thu được các chồi có chất lượng tốt cho các giai đoạn tiếp theo, chúng tôi tiến phối hợp giữa BAP, Kinetin và αNAA, IBA với các nồng độ khác nhau kết thu được từ thí nghiệm trên, BAP và kinetin khi sử dụng phối hợp theo tỷ lệ 0,5mg/l BAP + 0,3mg/l kinetin cho hiệu quả nhân nhanh tốt. Do đó, thí nghiệm được tiến hành trên nền môi trường trên phối hợp với IBA và α-NAA với các dải nồng độ từ 0,1 – 0,5 mg/l + 20g/l Sucrose + 20g/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar. Kết quả thí nghiệm được thể hiện qua Bảng 3.6.

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của sự phối hợp 2 nhóm chất là auxin và cytokinin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân (kết quả theo dõi sau 8 tuần)

Theo kết quả ở Bảng 3.6: Mẫu cấy trên môi trường chứa tổ hợp 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin + 0,3mg/l α-NAA cho số chồi cao nhất đạt (6,56 chồi/mẫu) nhiều hơn so với môi trường chứa tổ hợp 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin + 0,5mg/l IBA (4,85 chồi/mẫu) nhưng số đốt và chiều cao chồi thì lại thấp hơn. Sự phối hợp giữa cytokinin và auxin cho số chồi, số đốt và chiều cao chồi cao nhất (6,56 chồi/mẫu, 2,77 đốt/chồi và chiều cao trung bình chồi đạt 3,52 cm).

Như vậy, qua kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng tới sự phát sinh hình thái và hệ số nhân chồi thấy rằng công thức môi trường thích hợp nhất để nhân nhanh là: Knud* +0,5mg/l BAP + 0,3mg/l Kinetin + 0,3 mg/l α-NAA + 20g/l Sucrose + 20g/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar cho hệ số nhân cao, chất lượng chồi tốt, xanh, lá khỏe.

3.3. Nghiên cứu ra rễ tạo cây hoàn chỉnh

Cây nuôi cấy mô in vitro trước khi chuyển ra vườn ươm thường phải có bộ rễ hoàn chỉnh. Nếu rễ kém phát triển sẽ làm cho quá trình hút nước cũng như khả năng bám đất của cây bị ảnh hưởng nhưng ngược lại, bộ rễ phát triển mạnh sẽ làm ảnh hưởng tới chất lượng của các cơ quan khác. Do đó cần nghiên cứu để tìm ra môi trường ra rễ thích hợp cho cây.

Khi các chồi đạt tiêu chuẩn cho ra rễ, có chiều cao 3 – 5 cm , có 3 – 4 rễ, chồi mập khỏe, lá to, xanh thì được chuyển sang các môi trường ra rễ để tạo cây hoàn chỉnh.

Qua thí nghiệm trên, hai loại auxin là IBA và α-NAA đã được tiến hành nghiên cứu và cho kết quả là không có khả năng sản sinh ra rễ bất định đối với lan Kim tuyến (A. setaceus). Do đó trong nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nghèo dinh dưỡng và than hoạt tính đến sự ra rễ ở cây lan Kim tuyến (A. setaceus).

3.3.1. Ảnh hưởng của môi trường nền (môi trường không có chất điều tiết sinh trưởng) đến sự ra rễ

Lan Kim tuyến là một loại cây có yêu cầu về dinh dưỡng thấp, khi sống ở các môi trường nghèo dinh dưỡng thì rễ lan Kim tuyến sẽ kéo dài hơn để lấy dinh dưỡng cho cây. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu cho cây ra rễ trên môi trường nền nghèo dinh dưỡng, không có chất kích thích sinh trưởng để đánh giá môi trường nền ra rễ thích hợp và đánh giá khả năng ra rễ của mẫu Lan Kim tuyến trong điều kiện nghèo dinh dưỡng. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.7.

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của môi trường nền (môi trường không có chất điều tiết sinh trưởng) đến sự ra rễ (kết quả theo dõi sau 8 tuần)

Theo kết quả ở Bảng 3.7 cho thấy, môi trường Knud*/2 cho tỷ lệ tạo rễ cao nhất (100%), số lượng rễ nhiều nhất (2,17 rễ/chồi) và chiều dài rễ cũng cao nhất (2,47 cm), chồi mập và dài. Các môi trường khác đều cho các chỉ tiêu này thấp hơn, tỷ lệ tạo chồi dao động từ 66,67 – 83,33%; số lượng rễ dao động từ 1,25 – 1,87 rễ/chồi; chiều dài rễ đao động từ 1,6 – 2,3 cm; chồi ngắn hơn.

Như vậy có thể thấy rằng môi trường nghèo dinh dưỡng sẽ kích thích bộ rễ Lan Kim tuyến phát triển mạnh hơn và phát triển theo hướng phát triển chiều dài rễ.

3.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến sự ra rễ

Vai trò tích cực của than hoạt tính đã được chứng minh trong nhiều nghiên cứu trên các đối tượng khác nhau. Theo đó, than hoạt tính có tác dụng hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol, các sản phẩm trao đổi thứ cấp… Và đặc biệt, than hoạt tính làm thay đổi môi trường ánh sáng do làm cho môi trường sẫm màu, nên có thể kích thích sự hình thành và sinh trưởng của rễ (Vũ Văn Vụ, 2006). Vì vậy, trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng than hoạt tính với các nồng độ khác nhau bổ sung vào môi trường Knud* + 20g/l Sucrose + 7g/l agar để xác định vai trò của than hoạt tính đối với sự ra rễ của cây Lan Kim tuyến.

Kết quả trình bày ở Bảng 3.8.

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến sự ra rễ (kết quả theo dõi sau 8 tuần)

Kết quả xử lý thống kê hàm Anova một nhân tố cho thấy, nồng độ than hoạt tính khác nhau rõ ràng có ảnh hưởng đến tỷ lệ tạo rễ và chiều dài rễ và số lượng rễ của Lan Kim tuyến nuôi cấy mô.

Kết quả ở Bảng 3.8 cho thấy, bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy rõ ràng là có ảnh hưởng tích cực hơn đến sự hình thành của rễ cây lan Kim tuyến. Ở tất cả các môi trường bổ sung than hoạt tính đều cho tỷ lệ tạo rễ là 100%. Bổ sung than hoạt tính ở nồng độ 5% cho số lượng rễ nhiều nhất (4,22 rễ/chồi) và chiều cao rễ là 3,5 cm. Trong khi đó ở các nồng độ khác thì số lượng rễ thấp hơn dao động từ 2 – 3,83 rễ/chồi, đối chứng chỉ có 1,25 rễ/chồi, chiều cao dao động từ 2,89 – 3,2 cm, đối chứng là 1,6 cm. Chất lượng rễ của mẫu cấy ở môi trường có bổ sung 5% than hoạt tính là dài, mập và rất khỏe, ở cá nồng độ khác thì rễ ngắn và yếu hơn.

Căn cứ vào các chỉ tiêu đánh, chúng tôi cho rằng, than hoạt tính ở nồng độ 5% là có tác dụng kích thích sự hình thành và phát sinh rễ lan Kim tuyến tốt nhất

3.4. Nghiên cứu điều kiện ra cây thích hợp cho loài lan Kim tuyến (A. setaceus Blume) in vitro

3.4.1. Nghiên cứu giá thể phù hợp nhất cho việc ra cây loài lan Kim tuyến (A.

setaceus Blume) in vitro

CT 1: Giá thể 100% dớn

CT 2: Giá thể 50% Dớn + 50% xơ dừa

CT 3: Giá thể 100% xơ dừa

CT 4: Giá thể 100% bột dừa

Các giá thể được làm sạch, sấy khô và được ngâm nước trước khi đưa vào sử dụng. Sau 2 tuần đưa cây ra ngoài giá thể chúng tôi thu được kết quả theo Bảng 3.9

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của giá thể tới sinh trưởng và tỷ lệ sống của cây lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume)

Từ Bảng kết quả thu được, chúng tôi nhận thấy trên các giá thể khác nhau, tỷ lệ sống sót, khả năng sinh trưởng, phát triển của cây cũng rất khác nhau. Tỷ lệ sống sót và khả năng sinh trưởng tốt nhất của các cây con đạt được ở giá thể gồm 50% Dớn và 50% xơ dừa (CT2). Ở giá thể này, cây thích ứng rất nhanh, chỉ sau 7 -10 ngày trồng cây đã có biểu hiện sinh trưởng rõ rệt. Cây to, mập, lá có màu xanh đậm và cho tỷ lệ sống cao nhất đạt 66,32% và thấp nhất ở giá thể bột dừa đạt 33,76%.

Tuy Dớn và xơ dừa là giá thể phù hợp nhất cho loài lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume nhưng tỷ lệ sống thu được không cao do đó chúng tôi tiếp tục tiến hành các thí nghiệm nhằm nâng cao tỷ lệ sống cho giống lan in vitro này.

3.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian huấn luyện cây trong bình đến tỷ lệ sống của lan Kim tuyến khi trồng lên giá thể

Mục đích của giai đoạn huấn luyện là tạo điều kiện cho cây trong môi trường in vitro dần làm quen với môi trường tự nhiên bên ngoài. Sau khi được huấn luyện, cây con sẽ cứng cáp, khoẻ mạnh hơn và đạt tỷ lệ sống cao khi đưa ra trồng ngoài nhà lưới, vườn ươm… Có thể coi giai đoạn này như giai đoạn thuần hoá cây trước khi tách khỏi điều kiện in vitro.

Trong điều kiện in vitro, cây con được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng, ánh sáng nhân tạo và vô trùng, tức là đã quen sống dị dưỡng. Khi đưa cây con ra trồng trên giá thể ở ngoài tự nhiên, cây con phải sống tự dưỡng, xung quanh là môi trường không vô trùng, ánh sáng tự nhiên. Do vậy, huấn luyên cây in vitro cũng giúp cây chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang trạng thái bán tự dưỡng, để khi đưa cây ra trồng ngoài vườn ươm cây có thể tự dưỡng ngay mà không ảnh hưởng đến sự sinh trưởng. Thời gian huấn luyện khác nhau giúp cây có khả năng thích nghi với điều kiện môi trường bên ngoài bình khác nhau, do đó có ảnh hưởng đến tỷ lệ sống cảu cây con khi đưa ra trồng ngoài vườn ươm.

3.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ huấn luyện cây ở nhà lưới đến tỷ lệ sống của lan Kim tuyến khi trồng lên giá thể

Bảng 3.11. Ảnh hưởng của chế độ huấn luyện cây ở nhà lưới đến tỷ lệ sống của lan Kim tuyến khi trồng lên giá thể

Công thức CT2 và CT3 có tỷ lệ cây sống cao nhất (99%) và thấp nhất là công thức ĐC (80,33%). Sức sống của cây con ở các thời gian che bóng khác nhau cũng khác nhau khá rõ. Công thức CT2 cây phát triển tốt nhất, cây mập, lá dày và xanh non, rễ phát triển và bám giá thể tốt. Công thức CT5 rễ bám giá thể khá tốt nhưng cây mảnh và lá mỏng mang màu xanh nhạt hơn ở công thức CT2.

Công thức ĐC cho tỷ lệ cây sống thấp nhất. Tuy cây phát triển khá tốt nhưng độ bám của rễ vào giá thể rất kém nên không đạt tiêu chuẩn.

Những ngày đầu đưa cây ra trồng ở nhà lưới/vườn ươm, luống cây được phủ kín nilon để giúp cây con tránh bị mất nước do bay hơi. Nếu luống cây không được che kín bằng nilon, cây con sẽ bị mất nước khi trời nắng hoặc gió lùa khiến cho cây bị héo và chết. Tuy nhiên, thời gian che kín luống cây bằng nilon kéo dài sẽ khiến cây bị quá thiếu ánh sáng dẫn đến bị “ớm”, cây cao nhưng mảnh và lá xanh nhạt làm khả năng quang hợp kém, hay ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của cây con.

Như vậy, khi đưa lan Kim tuyến ra trồng ở vườn ươm thì nên che bóng trong vòng 10 ngày là thích hợp.

IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4.1. Kết luận

Dựa vào kết quả thu được từ các thí nghiệm chúng tôi rút ra các kết luận sau:

1. Phương pháp khử trùng tạo mẫu sạch in vitro và cơ quan vào mẫu thích hợp:

Rửa sạch bằng xà phòng rồi đem ngâm trong cồn 70o trong 10s sau đó ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút.

Cơ quan vào mẫu thích hợp nhất là mắt đốt ngang thân, cho tỷ lệ sống cao đạt khoảng 72%, tỷ lệ tạo chồi là 100% và hệ số nhân đạt 4,56 lần

2. Môi trường khởi động và nhân nhanh thích hợp:

– Môi trường nền thích hợp để nhân nhanh Lan kim tuyến (A. setaceus) là môi trường Knud* + 20g/l sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar

– Môi trường: Knud* + 1,0 mg/l BAP hoặc 1,0 mg/l Kinetin + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar.

– Môi trường nhân nhanh phù hợp nhất: Knud* + 0,5mg/l BAP + 0,3 Kinetin + 0,3mg/l αNAA + 20g/l sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar.

3. Xác định môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh:

– Môi trường phù hợp nhất cho sự ra rễ ở loài Lan kim tuyến là Knud*/2 + 5% than hoạt tính.

4. Xác định điều kiện ra cây thích hợp với loài Lan Kim tuyến

– Giá thể phù hợp nhất với loài Lan Kim tuyến là: 50% Dớn + 50% xơ dừa.

– Thời gian huấn luyện cây trong bình phù hợp nhất là 8 ngày – Thời gian che luống cây phù hợp nhất là 10 ngày cho tỷ lệ cây sống là 99%

4.2. Đề nghị

Do thời gian quá ngắn nên cây lan Kim tuyến vẫn chưa được đưa vào sản xuất trên quy mô công nghiệp nên chúng tôi đề nghị tiếp tục nhân và sản xuất ra với số lượng lớn nhằm bảo vệ nguồn dược liệu quý và đáp ứng nhu cầu sử dụng lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) hiện nay.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Nguyễn Tiến Bân (chủ biên), Danh lục các loài thực vật Việt Nam, Tập 3, Nxb. Nông nghiệp, Hà Nội, 2005.

2. Bộ Khoa học và Công nghệ, Sách Đỏ Việt Nam (phần thực vật), Nxb. Khoa học Tự nhiên & Công nghệ, Hà Nội, 2007.

3. Chính Phủ Nước Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam, Nghị định số 32/2006/NĐ-CP, 2006.

4. Lê Thị Kim Đào, “Nghiên cứu thử nghiệm nhân một số giống cây trồng rừng bằng phương pháp nuôi cấy mô (Bạch đàn, cây Hông, Giổi xanh, Trầm hương)”, Tạp chí sinh học, 23, 3, tr.46-50, 2001.

5. Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam, Quyển 3, Nxb. Trẻ, Tp. Hồ Chí Minh, 2000.

6. Dương Công Kiên, Nuôi cấy mô thực vật, Nxb. Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh, 2002.

7. Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống Lan Ngọc Điểm Tai Trâu (Rhynchostylis gigantea) bằng phương pháp nuôi cấy trong ống nghiệm, Báo cáo khoa học Trường Đại học Lâm nghiệp, 2007.

8. Phùng Văn Phê và nnk, Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống In vitro loài Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume), Báo cáo khoa học Trường Đại học Lâm nghiệp, 2009.

9. Phùng Văn Phê, Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nguyễn Trung Thành, Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi In vitro loài Lan Kim tuyến (Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl)”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, 26(4), 248-253, 2010.

10. Phùng Văn Phê, Nguyễn Trung Thành, Vương Duy Hưng. “Đặc điểm hình thái, phân bố của loài Lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume ở Vườn Quốc gia Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, 26(2), 104-109, 2010.

11. Nguyễn Thị Quỳnh (2005), “Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên sự tăng trưởng của một số cây thân gỗ nhiệt đới và cận nhiệt đới trong điều kiện nuôi cấy in vitro”, Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN, tr. 42-44, 2005.

12. Nguyễn Đức Thành, Nuôi cấy mô, tế bào thực vật, Nghiên cứu ứng dụng, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, 2000.

13. Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn, Sinh lý học thực vật, Nxb. Giáo dục, Hà Nội, 2007.

Tài liệu từ Internet:

53. Kim Sinh (2011). “Đua nhau vào rừng sâu “săn”…cỏ !”, http://baoxuan.giadinh.net.vn/30635p0c1000/dua-nhau-vao-rung-sau-san-co.htm.

54. http://congnghexanhviet.com/San-pham/Giong-cay-trong/28/GIONG-CAYCHAT-LUONG-CAO.html

55. http://caythuocviet.com.vn/cay-thuoc-vi-thuoc/Lan-kim-tuyen.html

Tác giả

Phí Thị Cẩm Miện. LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC. NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH IN VITRO LOÀI LAN KIM TUYẾN (ANOECTOCHILUS SETACEUS BLUME) NHẰM BẢO TỒN NGUỒN DƯỢC LIỆU QUÝ


【#4】Hướng Dẫn Cách Trồng Lan Trầm Vàng Nổi Bật

Trầm vàng mang vẻ đẹp nổi bật rực rỡ với hương thơm nồng nàn khiến lòng người có cảm giác an lòng như chính hương trầm trong các ngôi chùa yên bình. Đây là loài lan khá quen thuộc với nhiều người. Cây thường được trồng trong chậu chứ không bó vào thân gỗ như một số loài lan khác.

Lan trầm cũng được lai tạo công nghiệp tạo thành nhiều màu khác nhau như xanh, trắng, vàng đỏ. Tuy nhiên lan trầm vàng là loài được yêu thích và ưa chuộng nhiều nhất. Lan trầm vàng thường cho ra hoa vào mùa xuân đến đầu hạ khoảng tháng 3-5 hàng năm. Khi ra hoa trung bình chỉ có từ 1 -2 bông.

Chuẩn bị

– Chậu trồng

Chọn chậu có kích thước trung bình, không quá lớn cũng không quá nhỏ, nếu quá lớn rễ sẽ bị phân tán. Vì vậy chậu vừa giúp rễ lan tạo thành bó giúp cho chậu lan có dáng đẹp và vững chãi hơn.

– Cây lan giống: Lan chọn cần khỏe mạnh, gốc chắc chắn.

– Giá thể trồng: Xơ dừa, than củi

Tiến hành trồng lan Trầm vàng

Bước 1:

Cho khoảng 1/3 than củi vào chậu rồi tiếp theo cho lớp mỏng xơ dừa cắt ngắn độ dài khoảng từ 10-15cm vào trong chậu.

Bước 2:

Tiếp theo cho gốc lan trầm vàng vào trong chậu, giữ vững gốc lan sau đó đổ xơ dừa còn lại vào trong chậu để phủ mặt trên.

Bước 3:

Đặt xơ dừa không nên quá cao mà cách chậu 1-2 cm và ấn chặt để cố định cây lan.

Chăm sóc lan trầm vàng

Không nên để lan tiếp xúc quá nhiều và trực tiếp dưới ánh nắng mặt trời dễ khiến cây cháy lá và khó sinh trưởng, phát triển. Mức nhiệt độ thích hợp với cây lan trầm vàng khoảng từ 18-25 độ C

Tưới nước

Cần duy trì một tuần tưới nước 1-2 lần duy trì mức độ ẩm từ 60-70%.

Khi nào cây ra hoa, nhiệt độ duy trì trong khoảng từ 13-15 độ.

Lan trầm vàng cần giảm lượng nước tưới vào mùa mưa để tránh gây tình trạng ngập úng, sâu bệnh hại. Trong thời tiết này bạn có thể dùng cách phun sương nhẹ tưới qua một lượt để lan thấm đều nước và hạn chế tối đa mức cần quá nhiều nước

Phân bón

Trong thời kì cây ra hoa bạn nên bón mỗi tuần một lần hàm lượng phân bón NPK theo tỉ lệ 3-1-1 hay 2-2-2 đầy đủ cho cây. Nếu cây có dấu hiệu úa vàng, chuẩn bị rụng lá thì chuyển sang tỉ lệ 1-3-2 để kích thích cây ra nụ và nở hoa đúng thời hạn

Thay chậu

Việc thay chậu đúng thời gian quy định sẽ giúp cây thoáng khí thuận lợi cho quá trình trao đổi chất.

– Nếu chọn chậu có sử dụng vỏ dừa hoặc vỏ cây, nên tiến hành thay chậu mới 2 năm/lần.

– Sau khi tiến hành trồng lan trầm vàng vào chậu thì khoảng 1-2 tuần sau tưới nước trở lại để cây thích nghi dần với môi trường sống

Cây lan trầm vàng nói riêng và các dòng lan nói chung rất cần sự thoáng khí và sự rung chuyển để cho cây được tươi tốt hơn. Kinh nghiệm cho thấy thì cây để ngoài vườn thường xuyên có gió và khí tự nhiên sẽ giúp cây mọc tốt hơn là trong nhà kín ít có gió và nắng.


【#5】Vanda Rừng Cao Bằng (Vanda Concolor

Lan Vanda là một loại phong lan có nhiều màu sắc sặc sỡ, xuất xứ từ vùng Châu Á Thái Bình Dương. Lan Vanda được chia thành 3 loại: loại lá dẹp (strap-shaped leaves), loại lá tròn (cylindrical or terete leaves), và loại lá nửa tròn nửa dẹp (semi-terete leaves). (Vanda rừng Cao Bằng còn được gọi là vanda nâu, tên khoa học là Vanda Concolor). Lan Vanda rất đẹp, hình dáng vừa tròn lại vừa dày nên được rất nhiều người ưa thích trồng.

Vanda rừng Cao Bằng (Vanda Concolor

Hoa Lan Vanda thường tươi lâu từ 4 đến 8 tuần, tuỳ theo khí hậu và giống. Có vài loại Lan Vanda tỏa mùi thơm như Vanda amesiana, V. denisonianum, V. cristata và V. dearei. Có loại có vân như Vanda coerulea hoặc đốm như V. tricolor hay V. sanderiana. Ở Cao Bằng chủ yếu là có Vanda nâu và vanda chanh.

Trồng Lan Vanda không khó, nếu ta trồng đúng cách và tạo đủ điều kiện thích hợp cho cây phát triển thì cây sẽ sống lâu và ra hoa thường xuyên. Độ ẩm: Cây Lan Vanda thích ở độ ẩm ban ngày vào khoảng 60% đến 70%, và ban đêm là khoảng 90% đến 95% thì cây sẽ phát triển nhanh.

Nếu thiếu độ ẩm cây sẽ mau khô ở rễ và dẫn đến héo lá. Cây sẽ khó ra hoa nếu thiếu độ ẩm hoặc thiếu nước.

Vanda rừng Cao Bằng đang ra nụ (Ảnh: Nông Triệu Thủy)

Tưới nước: Cây Lan Vanda rất thích nước. Vào mùa hè thì cây phát triển rất nhanh nên cần nhiều nước. Ta có thể tưới nước mỗi ngày và 2 lần một ngày mà không sợ bị thối rễ nếu cây được trồng trong rổ không có nguyên liệu. Vào mùa đông bớt tưới nước lại, chỉ cần 2 lần trong 1 tuần là đủ. Khi thấy lá nhăn và mềm tức là cây đang bị thiếu nước trầm trọng, chúng ta cần tưới nhiều hơn. Thiếu nước cũng là nguyên nhân khiến Lan Vanda khó có thể ra hoa.

Bón phân: Vào mùa Đông bớt bón phân hoặc chỉ cần tưới nước là đủ. Vào mùa Xuân thì ta nên bón phân nhiều hơn để kích thích cây phát triển và ra hoa. Khi ra hoa thì tiếp tục bón phân vì Lan Vanda tiêu thụ rất nhiều phân bon. để nuôi lá và hoa. Cây Lan Vanda giống như Lan Hoàng Hậu (Cattleya) và Lan Đất (Cymbidium) rất thích phân có nhiều chất nitro vì chịu nhiều ánh sáng. Thường thì ta có thể dùng ½ muỗng café phân bón (20-20-20) hoà tan vào 1 gallon nước để tưới cây. Loại phân này có thể dùng được quanh năm. Khi nào thấy rễ bị cháy tức là quá nhiều phân bón nên dừng lại một thời gian và chỉ tưới nước thôi là đủ. Chúng ta sẽ tưới phân lại khoảng 2 tuần sau đó.

Ánh sáng: Cây Lan Vanda ưa nhiều ánh sáng hoặc nắng nhưng không sống trực tiếp dưới ánh sáng như ở Nam California, vì sẽ dễ bị cháy lá. Khi thấy lá cây đổi màu vàng tức là nhiều ánh sáng quá. Nếu lá cây xanh đậm tức là thiếu ánh sáng, có thể sẽ không ra hoa được. Chúng ta có thể trồng Lan Vanda ngoài sân và sử dụng lưới 50%-55% để lọc bớt ánh sáng. Loại lá tròn thì cần nhiều ánh sáng hơn loại lá dẹp.

Nụ Vanda nâu (hàng rừng Cao Bằng)

Nhiệt độ: Cây Lan Vanda thích ở nhiệt độ ban đêm từ 50-60°F, ban ngày từ 70-90°F. Ở nhiệt độ cao chúng ta có thể tưới cây thường xuyên hơn như 2 hoặc 3 lần trong 1 ngày. Ở nhiệt độ thấp thì phải cẩn thận khi tưới nước, vì nếu tưới nước nhiều mà lạnh thì cây dễ bị nấm và rụng lá ở dưới gốc đi lên, như hình cây dừa.


【#6】Ý Nghĩa Hoa Lan Hồ Điệp

Đã bao giờ bạn tự hỏi hoa lan nói chung và hoa lan hồ điệp nói riêng tượng trưng cho ý nghĩa gì? Đó là loài hoa đẹp và phổ biến mà có nhiều ý nghĩa khác nhau.

Không giống như hầu hết các loài hoa khác có cánh hoa hình tròn, hoa lan có cánh hoa theo dạng hình hình học. Không có gì là ngạc nhiên, những bông hoa xinh đẹp được sử dụng để chuyển tải thông điệp đặc biệt.

Hoa lan hồ điệp từ lâu đã được phong tặng danh hiệu của sự cao sang, quý phái trong số hàng trăm loài phong lan. Bên cạnh đó, nó còn biểu tượng cho sự ngây thơ và trong sáng.

Vậy, lan hồ điệp biểu tượng cho ý nghĩa gì?

Nếu bạn là một người yêu phong lan, bạn sẽ vui mừng khi biết rằng những bông hoa kỳ lạ là một biểu tượng của tình yêu, vẻ đẹp và sự thánh thiện trong hầu hết các nền văn hóa trên thế giới. Đây cũng là biểu tượng chính yếu của hoa phong lan …

Tình yêu: Hoa lan hồ điệp được coi là biểu tượng của tình yêu bởi vì thực tế là các cây trồng lớn lên dễ dàng, và nở hoa dưới hầu hết các điều kiện. Trong thời kỳ Victoria, hoa được xem là món quà kỳ lạ và hiếm để thể hiện tình yêu và tình cảm. Người ta thậm chí còn tin rằng, bạn càng chọn quà ít hoa bao nhiêu, thì tình yêu của bạn càng sâu đậm bấy nhiêu. Trong các bộ phận của châu Âu, hoa lan đã được sử dụng như một thành phần quan trọng trong lựa chọn tình yêu.

Hoàn thiện và sắc đẹp: Bởi vì sự đối xứng hoa, và các đường thẳng trên cánh hoa, lan hồ điệp đại diện cho vẻ đẹp trong đối xứng, và coi là hình ảnh tiêu chuẩn cho vẻ đẹp hiếm thấy. Ở Anh thời Victoria, những bông hoa đáng yêu được ví như một người phụ nữ xinh đẹp. Thật thú vị, thậm chí là một trang phục của người phụ nữ trong thời đại có một sự tương đồng nổi bật với hoa. Những người Trung Quốc cổ đại xem cánh hoa lan là hình ảnh thu nhỏ của sự hoàn hảo của con người.

Sang trọng và Sung túc:

Vâng, có vẻ như người dân của nước Anh trong thời đại Victoria đã gắn rất nhiều ý nghĩa cho những bông hoa lan xinh đẹp, khi hoa cũng được coi là biểu tượng của sự sang trọng. Đây có lẽ là bởi vì những hoa hiếm chỉ có ở vùng nhiệt đới, và do đó, chỉ có những người giàu có mới đủ khả năng thưởng lãm hoa. Ở Nhật Bản cổ đại, hoa lan rất được trân trọng trong hoàng gia, và được coi là biểu tượng của sự giàu có.

Từ xưa đến nay, lan vẫn được biết đến như một loài hoa quý phái, hoa của bậc vua chúa vương giả. Lan Việt Nam cũng rất đa dạng về chủng loại và chứa đựng nhiều ý nghĩa.

Riêng lan hồ điệp được mệnh danh là ” nữ hoàng của các loài hoa”. Hồ điệp không chỉ có ý nghĩa là sự cao sang, quý phái mà còn là sứ giả truyền tải cảm xúc một cách nhẹ nhàng, hoa còn mang đến cho chúng ta vẻ đẹp tinh khiết của tự nhiên, nét quyến rũ cho không gian sống.

Hoa có màu sắc phong phú từ trắng, hồng, đỏ, vàng, tím và có loài có sự phối màu tự nhiên như có đốm hay sọc…, cấu trúc kỳ diệu và đặc tính tươi lâu có thể sống từ 1 đến 2 tháng, trở thành quà tặng có giá trị cao trong những dịp Tết đến Xuân về.

Khả năng sinh sản: Hoa lan từ lâu đã được liên kết với khả năng sinh sản và sinh lực. Trong Hy Lạp cổ đại, người ta tin rằng việc dùng các loại các loại củ rễ có thể xác định giới tính của thai nhi chưa sinh. Nếu là cha đẻ của đứa trẻ chưa sinh ăn rễ lớn của cây lan, vợ của anh ta có khả năng sinh một cậu con trai. Mặt khác, nếu người mẹ mong đợi ăn củ lan nhỏ, cô có thể cho ra đời một bé gái. Do niềm tin này khá phổ biến, hoa lan đã trở thành quà tặng phổ biến cho các cặp vợ chồng đang mong con. Ở Trung Quốc cổ đại, hoa lan đã được xem là biểu tượng con đàn cháu đống.

Ý nghĩa của màu sắc khác nhau của hoa lan hồ điệp

Lan hồ điệp màu xanh: rất hiếm do đó nó là biểu tượng cho sự cao quý, quý giá. Ngoài ra nó còn là biểu tượng cho sự tâm linh và thiền định.

Lan hồ điệp màu trắng: là biểu tượng của sự ngây thơ, xinh đẹp và trang trọng. Bạn có thể dùng chậu hoa lan hồ điệp trắng làm món quà để tặng cho người thân yêu của mình

Lan hồ điệp màu hồng: tượng trưng cho niềm vui, hạnh phúc, và ngây thơ. Vì vậy một chậu lan hồ điệp hồng là món quà có ý nghĩa cho ngày kỷ niệm đám cưới tại các shop hoa lan hồ điệp.

Lan hồ điệp màu vàng: tượng trưng cho tình bạn và sự khởi đầu mới. Vì vậy bạn có thể dùng một chậu lan hồ điệp để làm hoa khai trương

Lan hồ điệp màu tím (lavender): là biểu tượng của sự dung thứ, sang trọng và vẻ đẹp nữ tính. Đây là món quà thích hợp để tặng cho mẹ trong ngày 8-3 nhé.

Lan hồ điệp màu đỏ tía: tượng trưng cho hoàng gia, sự ngưỡng mộ và tôn trọng. Bạn có thể dùng nó để làm hoa tặng sếp nam nhé.


【#7】Top 9 Loài Lan Vũ Nữ Được Ưa Chuộng Nhất Hiện Nay

Lan vũ nữ là loài lan rất đa dạng và phong phú và được mệnh danh là loài hoa lan đẹp nhất thế giới với màu sắc cực kỳ đa dạng và hình dáng hoa uyển chuyển, mềm mại. Lan vũ nữ biểu trưng cho tình yêu thầm kín, sự cầu mong người mình yêu được hạnh phúc. Trong công việc: Hoa màu vàng tượng trưng cho sự sinh sôi nảy nở, ăn nên làm ra nên thường được dùng để tặng vào các dịp khai trương. Trong tâm linh: Khi bạn ngủ mơ thấy lan vũ nữ đó là điềm may. Bạn sẽ nhanh chóng vượt qua những khó khăn và gặp nhiều may mắn trong cuộc sống. Hãy cùng điểm mặt Top 9 loài lan vũ nữ được ưa chuộng nhất hiện nay trong bài viết dưới đây nhé!

Top 9 loài lan vũ nữ được ưa chuộng nhất hiện nay

Đây là một trong những loài lan vũ nữ có màu sắc và cách phối hoa cực kỳ độc đáo, Vì nó có rất nhiều màu và có thể phối hợp đa dạng nên người ta đã đặc cho nó cái tên là lan vũ nữ bút chì

Đây là loài hoa có hình dáng khá đặc biệt vì khi kết hợp giữa màu sắc và cánh hoa thì cho ra hình dạng giống một cô phù thủy hơn là một mụ phù thủy. Bạn có muốn sở hữu một cô phù thủy đáng yêu và hiền lành này không nào?

Đây là một trong những loại lan vũ nữ được nhiều người ưa chuộng và sưu tầm vì có sắc tím mộng mơ và lan tỏa cả một khu vườn.

Là loại cây giống gốc lan rừng Nam Mỹ. Cây phát triển đa thân, một thân thì khá giống loại Vanda. Cây phát triển tốt khoẻ mạnh, dễ ra hoa. Vòi hoa dài, phân chi rất đẹp. Cánh hoa màu hồng, uốn lượn như đàn bướm.

Chăm sóc: cây thích ghép gỗ, dớn miếng, trồng giá thể nhuyễn như than, vỏ thông nhỏ (vì rễ nhỏ), cố định cây chắc. Ngày tưới nước 2 lần (và không được để khô), ánh sáng như các loại lan khác. Không tưới phân hóa học cho cây.

Dòng vũ nữ hoa tuyệt đẹp, bộ lá to tròn rất khỏe, vòi hoa phân nhánh nhiều hoa. Cây rất siêng hoa, chỉ cần ra vài lá là có vòi hoa, trồng lâu, vòi hoa dài rất hoành tráng. Hoa rất thơm.

Được biết, hoa Lan Vũ nữ mật ngọt là một loại lan gồm khoảng chừng 600 giống mọc tại các miền thuộc Nam Mỹ, các nước nhiệt đới Brazin, Pêru, Mêhicô và phân bố ở giải quần đảo Tây Ấn Độ. Tên thường gọi: Lan Vũ nữ. Tên khoa học: Oncidium lexuosum. Họ thực vật: Orchidaceae (Phong lan).

Lan Vũ Nữ mật ngọt là một trong 3 loài hoa được thế giới công nhận đẹp nhất, trở thành loài hoa quan trọng để cắm nghệ thuật và trồng làm chậu treo trang trí. Mỗi cành hoa phải có 1/3 số bông hoa nở mới được hái và thường có hơn 100 hoa trên 1 cành rất phổ biến ở Việt Nam nước ta.

Đây là một loại lan vũ nữ độc đáo tiếp theo vì hình dạng giống một con nhện đang bò nhanh, và loài hoa này cũng có rất nhiều kiểu dáng khiến người ta phải trầm trồ

Mô tả: Den Hibiki được lai từ 2 cây Bracteosum x Laevifolium, là dòng Dendro mini khá đặc biệt khi vòi hoa mọc từ dưới gốc, một số mọc mọc ở thân. Thân cũng có màu sắc lạ mắt khác với màu xanh thông thường của những loại khác. Cây có thể chơi thân, là vì điểm đặc biệt này của nó.

Cây thích hợp khí hậu ấm ấp, siêng hoa, ra hoa trên cả giả hành nhỏ, hoa lâu tàn, nếu trồng nhiều nắng thân lá sẽ có màu tím rất đẹp

Là một lan vũ nữ phát triển lớn hơn với lá dài đến khoảng 12 inch (30 cm), nó cho thấy ảnh hưởng nhiều từ một trong những cha mẹ của loài hoa này là Oncidium lanceanum, với tán lá tai la và phẳng của nó, có mùi thơm mật ong, hoa lâu tàn của sự tương phản màu nâu và màu vàng với một môi vàng.

Lan vũ Nữ Sharry baby có màu trắng và nâu đỏ, màu sắc tuy không được rực rỡ nhưng thật đẹp và quý phái. Lá Vũ Nữ Sharry baby thường có nhiều đốm nâu, tuy không lây bệnh sang các loài Vũ Nữ khác, nhưng nó không thể nào diệt trừ được bệnh này dù đã dùng nhiều loại thuốc trừ nấm bệnh khác nhau. Trước đây, khi để giả hành phát triển tự nhiên chen kín trong chậu, cây ra hoa rất nhiều và rất mạnh. Sau này, khi sang thành 2 chậu thì cây yếu đi và ít hoa hơn.

Một loại lan vũ nữ khá hấp dẫn với hoa màu đỏ rỉ kích thước hoa đạt 3-inch (8-cm) và môi với những mảng màu vàng và màu da cam trên môi. Những hoa chịu trên một cành dài và lá của nó có thể dài khoảng 6 đến 8 inches (15-20 cm). Tuy nhiên, hoa có mùi mốc.


【#8】Cách Trồng Lan Giả Hạc Daklay

Là một tay chơi lan thứ thiệt hẳn ai cũng mong muốn sở hữu cho mình “bộ sưu tập” đa sắc màu. Trong “bộ sưu tập” ấy không thể thiếu giả hạc Đaklay – một giống lan độc đáo, mang màu sắc rất riêng, với hương thơm quyến rũ làm say đắm lòng người. Vậy làm sao để có được một giò Lan Giả Hạc Daklay không chỉ có sắc hoa đẹp mà còn có hương thơm nồng nàn? Nếu bạn có ý định sở hữu loài hoa này thì đầu tiên phải biết được cách trồng Lan Giả Hạc Daklay . Và đọc ngay bài viết này để ghi nhớ những lưu ý về cách trồng Lan Giả Hạc Daklay sau đó tự đúc kết ra phương pháp tối ưu cho khu vườn của bản thân.

CÁCH TRỒNG LAN GIẢ HẠC DAKLAY

Giống lan rừng độc đáo cho nhiều hoa, màu sắc đẹp, nhẹ nhàng, có hương thơm quyến rũ

Dễ trồng, dễ thích nghi, đạt năng suất cao

Khả năng kháng bệnh tốt, độ bền của hoa 10 -15 ngày

Giống lan rừng quý hiếm, thỏa mãn nhu cầu chơi lan, có tiềm năng kinh tế cao

Lan Giả hạc ĐăkLay có tên khoa học là Dendrobium Anosmum được trồng nhiều ở vùng Đăklay. Sở dĩ có cái tên Đaklay là do gọi theo tên vùng trồng. Do sự biến đổi đặc tính theo vùng mình nên giả hạc trồng ở vùng này cũng có những đặc điểm khác biệt với các dòng khác. Giả hạc ĐăkLay là giống lan rừng nhiệt đới rất quý hiếm, cho hoa đẹp, có hương thơm quyến rũ.

Về đặc điểm, cây lan Gỉa hạc ĐăkLay giống rừng, loại đốt ngắn, thân thòng. Cây ra hoa khi giả hành đã rụng hết lá, có một số cây sẽ có lá xanh tốt quanh năm. Cánh hoa giả hạc Đaklay nhìn có vẻ mỏng manh, có màu trắng hoặc trắng phớt tím, lưỡi tím.

Là một trong những giống phi điệp hot nhất hiện nay vì sự độc đáo, giá trị kinh tế cao nên được nhiều người săn tìm để thỏa mãn thú vui tao nhã hoặc trồng để kinh doanh.

Mang trong mình vẻ đẹp của sự quyến rũ, những cánh hoa tím trắng đủ sức làm say đắm những ai một lần ngắm nhìn. Không chỉ có vậy, loài hoa tượng trưng cho sự may mắn và sang giàu này chắc chắn sẽ trở thành “sản phẩm” kinh doanh có tiềm năng kinh tế cao cho những ai thật sự có niềm đam mê chơi lan và nắm rõ “quy luật” phát triển của nó. Bạn đã từng nghĩ sẽ kinh doanh một trang trại giả hạc Đăklay?

Còn chần chờ gì mà không sở hữu ngay một chậu Lan Giả Hạc như thế. Kết bạn zalo với Vườn Lan Tây Chi qua số điện thoại 0849.333.978. Mua sĩ liên hệ thầy giáo Lâm 0949.326.728. Hoặc bạn để lại thông tin phía dưới nhà vườn sẽ liên hệ gửi mẫu cây cho bạn nhé!

01 Cây Con Lan Giả Hạc Đaklay (Gieo hạt)

1. Vật liệu, dụng cụ

Một số kiến thức về cách trồng Lan Giả Hạc Daklay mà người chơi lan cần biết:

Với giả hạc Đaklay, bạn có thể trong bằng sơ dừa theo cách bó vào dớn hoặc các khúc gỗ như các giống phi điệm khác. Riêng với giả hạc, chúng lại phát triển tốt trong các chậu nhỏ, có diện tích chật. Do vậy bạn có thể trồng trong chậu, điều kiện là chậu nên được đặt nằm và có khả năng thoát nước tốt.

2. Nhiệt Độ

Khả năng chịu nóng và lạnh của Gỉa hạc Đaklay rất tốt. Mùa nóng, nhiệt độ tối đa có thể lên đến 38 độ C, mùa lạnh có thể xuống mức 3,3 độ C. Điều kiện nhiệt độ cần đảm bảo để giả hạc Đaklay ra nụ là phải 15-16 độ C kéo dài trong 4-6 tuần. Do vậy, ở những vùng nắng nóng như thành phó HCM nếu muốn trồng giả hạc Đaklay cần cho vào nhà và bật điều hòa.

3. Ánh sáng

Ngoài cách trồng Lan Giả Hạc Daklay, bạn cần chú ý đến ánh sáng. Nhìn chung các loại giả hạc đều ưa nắng, tuy nhiên khi trồng giả hạc bạn cần chú ý về yếu tố ánh sáng cho phù hợp. Bạn chỉ nên cho giả hạc Đawklay tiếp úc ánh sáng mặt trời trực tiếp trong thời gian gần ra hoa. Khi cây đã ra hoa và trong giai đoạn phát triển lá non không nên tiếp xúc trực tiếp ánh nắng mặt trời vì có thể làm cháy lá non.

4. Độ ẩm

Liên quan đến cách trồng Lan Giả Hạc Daklay, bạn cũng cần quan tâm đến độ ẩm. Khi thiết kế bạn phải bảo đảm vườn lan luôn thông thoáng và có ẩm độ từ 60 – 70% để cây có thể phát triển tốt, đặc biệt là khi cây còn non và trong thời gian ra nụ. Nếu thiết kế vườn không hợp lý thì cây con sẽ teo dần và chết, đến mùa cũng có rất ít hoa.

5. Tưới nước

Bổ sung nước cho Gỉa hạc Đăklay còn tùy thuộc vào từng mùa.

– Mùa hè: 2-4 lần/ tuần

– Mùa thu: tưới 1 lần/ tuần nếu thấy cây tăng trưởng chậm

– Mùa đông: Thời điểm này cây sắp ra nụ, để đảm bao cây ra nhiều hoa nhất thì bạn phải kết hợp tưới phun sương 2 lần/tháng nếu cây có độ ẩm thấp.

6. Phân bón

– Tháng 2-9: Hàm lượng phân bón 15-15-15

– Tháng 9-11: Hàm lượng phân bón 10-30-10.

– Tháng 12: Nên ngưng hẳn việc bón phân lại.

Ngoài lan giả hạc Đaklay, giả hạc cũng còn nhiều loại đột biến độc đáo khác như: Gỉa hạc 5 cánh trắng kim, 5 cánh trắng Phú Thọ, 5 cánh trắng Hòa Bình, Giả hạc Dilinh Xuân,… Do vậy, nếu bạn thật sự là một người đam mê việc trồng và thưởng lãm hoa lan, đặc biệt là dòng giả hạc nói riêng thì hãy bổ sung thêm nhiều dòng lan quý hiếm này bạn nhé!

01 Cây Con Lan Giả Hạc Đaklay

VƯỜN LAN TÂY CHI tự hào là đơn vị nhà vườn uy tín, chuyên cung cấp sỉ lẻ các loại lan rừng, quý hiếm cho các bạn yêu lan trên toàn quốc. Ngoài ra chúng tôi còn phân phối các loại vật tư trồng lan định kỳ cho các nhà vườn khác và anh em chơi lan số lượng lớn tại Inkndrinkmarkers.com và một số tỉnh thành lân cận. luôn lấy chất lượng sản phẩm làm giá trị cốt lõi cho sự phát triển của mình. Vì vậy, chúng tôi cam kết giao cho khách hàng những sản phẩm chất lượng, đúng chủng loại, đúng hình chụp gửi đã được khách duyệt.

Với niềm đam mê và tình yêu mãnh liệt đối với các dòng Lan đã thôi thúc người Thầy Giáo Tên Lâm tại Đơn Dương – Lâm Đồng sưu tầm các giống lan rừng độc lạ, quý hiếm. Sau nhiều năm gom góp kinh nghiệm, thầy đã dựng riêng cho mình một vườn lan phong phú, đa dạng và đặt tên là Tây Chi.

Vườn Lan Rừng Tây Chi sưu tầm các giống lan từ chính tay các anh em đồng bào Tây Nguyên đi rừng lấy về, nuôi dưỡng và chăm sóc và nhân giống. Cây hoa tại vườn đảm bảo khỏe mạnh, đúng giống, được lựa chọn kỹ càng, mặt hoa luôn sáng đẹp đến tay người chơi với mức giá hợp lý.

với Vườn Lan Rừng Tây Chi 12 năm kinh nghiệm, tự hào là đơn vị nhà vườn uy tín, chuyên cung cấp sỉ lẻ các loại lan rừng, quý hiếm cho các bạn yêu lan trên toàn quốc.Nhà vườnluôn lấy chất lượng sản phẩm làm giá trị cốt lõi cho sự phát triển của mình.Chuyên cung cấp các giống lan rừng Tây Nguyên cũng như cung cấp sỉ lẻ các loại lan rừng, quý hiếm cho các bạn yêu lan trên toàn quốc.

luôn Nhà vườn săn tìm, sưu tầm các giống phong lan rừng có hoa rất đẹp và thơm như: Lan Ngọc Điểm rừng campuchia, Lan dã Hạc campuchia, Lan Ngọc Điểm Lào, Lan Ngọc Điểm Nha Trang, Lan Ngọc Điểm Thái, Lan Ngọc Điểm Đai loan… Hoàng Thảo kèn, Lan dã hạc các loại, Long tu Đá Ý Ngọc, Trúc phật bà, Chuỗi ngọc, Kim Điệp, lan Báo hỷ, Hoàng thảo đùi gà, Thủy tiên tím và thủy tiên vàng (kiều tím, kiều vàng), Sóc Lào, Trầm Rừng, Hương Duyên, Thập Hoa, Hương Vani, Vẩy Rồng, Tóc tiên, Ngọc Thạch, Thủy tiên tím, Lan long tu, lan hỏa hoàng, nhất điểm hồng…Và một số loại hoa đột biến.


【#9】Cách Trồng Lan Đất Hạc Đỉnh

Giống Fhaius gồm hơn 50 loài được biết, đấy là một trong các giống nhiều nhất của nhóm lan đất. Sự phân bố của giống khá rộng từ Đông Phi và Madagaxca, qua châu Á nhiệt đới và Inđônêxia, đến Tân Calêdonia và quần đảo Fiji, giống Phaius là họ hàng thân ,cận của giống Calanthe.

Cách trồng lan đất Hạc Đỉnh

Ở Việt Nam có 4 loài Phaius được biết là Pllaius tankervilliae. Phaius indigofera, Phaius mishlllensis, Pllaius flavusnhưng chỉ có loài đầu mới thực sự có hoa đẹp, loài này mọc rất nhiều từ Di Linh đến Lang Hanh trong các tràng trống có đầm lầy trong rừng, chúng thường mọc xen với các loài cỏ dại và các loài lan khác tên là Ngãi bưởi (Dipodium paludosum) Vân hài (Paphiopedilum callosulll), Cau diệp ngà (Spathoglottis eburnea).

Hạc đỉnh thuộc nhóm đa thân với các giả hành hình tháp lá to rộng 15 x 60cm, hoa to với đường kính 12cm, gồm rất nhiều màu sắc khá đặc biệt. Hoa có mùi thơn, lưỡi hình ống như Cattleya, đài và cánh có màu sắc giống nhau, mặt sau màu trăng sữa, mặt trước tùy theo thứ loài do quá trình lai tạo tự nhiên, có nhiều màu biến đổi từ nâu đỏ, sôcôla, đến vàng xanh.

Hạc đỉnh là một trong những cây lan nhiệt đới đầu tiên nở hoa Ở Châu Âu. Đây là loại lan hoàn toàn chịu ầm, điều kiện sinh thái tự nhiên là các vùng đầm lầy, vì thế khi bị úng nước ở giá thể sẽ không làm cây chết. Hạc đỉnh có thể trồng được ở vùng Á nhiệt đới và vùng nóng, nhiệt độ thích hợp cho nó từ 10oC – 25oC.

Tuy nhiên ở vùng nguyên quán Cao Nguyên Nam Trung Bộ, Hạc đỉnh trổ hoa vào tháng 1-2, và nếu được trồng ở thành phố HỒ Chí Minh, cây lan lại ra hoa vào tháng 3. ánh sáng cần thiết từ 8.000-15.000 1nl/m2. Hạc đỉnh là loại lan duy nhất trong giống có thể kinh doanh trên phương diện thương mại thường dùng dưới dạng hoa cất. Dù rằng hoa Hạc đỉnh rất bền, chơi được từ 1-2 tháng, hoa đẹp và có mùi thơm, nhưng khuyết diềm của loài này là nếu va chạm cành hoa dù nhẹ cũng gây phản ứng sinh hóa, tạo ra những vết sẹo màu đen rất xấu.

Phải cẩn thận khi di chuyển cây lan Hạc đỉnh đang có hoa. Muốn ngừa khuyết diềm trên, nếu cây Hạc đỉnh trồng ở nơi xa trên vài trăm cây số, phải di chuyển Hạc đỉnh đến nơi trưng bày từ khi phát hoa còn rất ngắn (O,5m). Hai tháng sau khi nuôi dưỡng trở lại, những vết sẹo màu đen sẽ mất hán, cây sẽ trổ hoa rất đẹp không khác gì cây bình thường.

Hạc đỉnh là loài lan đất nên giá thể gồm 2 phần tro trấu, 1 phần đất mùn + 1 phần phân bò hoại + l/20 bánh dầu xay nhuyễn có thể tưới thêm phân 30-10-10, tưới 2 lần/tuần trong suốt mùa tăng trưởng. Suốt năm nước được tưới 1 ngày 3 lần. Chỉ trừ 1 tháng sau khi hoa trổ, cho cây nghỉ hoàn toàn không tưới. Một giá thể khác tỏ ra hữu hiệu hơn: một phần tro trấu + 1 phần rơm mục + 1 phần phân bò hoại + 1/20 bánh dầu xay nhuyễn. Lan Hạc đỉnh có thể nhân giống đơn giản bằng 1 giả hành như Cymbidium.

Tuy nhiên với số lượng giả hành càng nhiều cây càng tăng trưởng mạnh, tối thiểu là 3 giả hành để đảm bảo cho cây ra hoa trong mùa tới. Ngoài ra cây Hạc đỉnh còn có thể nhân giống bằng phát hoa như một số loài thuộc giống Phalaenopsis, khả năng phát triển của cây con trên mỗi đốt của phát hoa rất mạnh. Khi Hạc đỉnh vừa tàn, ta cất phát hoa lìa khói giả hành và nhúng vào parafin đặt nằm ngang trên mặt cát hay luồn trong các đám cỏ dại hoặc bất cứ nơi nào có ẩm độ 100% với ánh sáng yếu 30%.

Sau thời gian chừng 3 tháng, hầu như mỗi đốt của phát hoa đều mọc một cây con, trong khi đó trục sẽ thối dần. Lúc ấy ta đem trồng từng cây vào các chậu tương xứng với giá thể như đã nói trên và cây sẽ ra hoa sau thời gian 4 năm. Hạc đỉnh ít bị sâu bệnh, thường bị sâu ăn lá và các loại cào cào cắn phá. Đây là loài hoa rất lý tưởng để trang trí các phòng khách, phòng họp có không gian rộng.

Giống Fhaius gồm hơn 50 loài được biết, đấy là một trong các giống nhiều nhất của nhóm lan đất. Sự phân bố của giống khá rộng từ Đông Phi và Madagaxca, qua châu Á nhiệt đới và Inđônêxia, đến Tân Calêdonia và quần đảo Fiji, giống Phaius là họ hàng thân ,cận của giống Calanthe.

Ở Việt Nam có 4 loài Phaius được biết là Pllaius tankervilliae. Phaius indigofera, Phaius mishlllensis, Pllaius flavus nhưng chỉ có loài đầu mới thực sự có hoa đẹp, loài này mọc rất nhiều từ Di Linh đến Lang Hanh trong các tràng trống có đầm lầy trong rừng, chúng thường mọc xen với các loài cỏ dại và các loài lan khác tên là Ngãi bưởi (Dipodium paludosum) Vân hài (Paphiopedilum callosulll), Cau diệp ngà (Spathoglottis eburnea).

Hạc đỉnh thuộc nhóm đa thân với các giả hành hình tháp lá to rộng 15 x 60cm, hoa to với đường kính 12cm, gồm rất nhiều màu sắc khá đặc biệt. Hoa có mùi thơn, lưỡi hình ống như Cattleya, đài và cánh có màu sắc giống nhau, mặt sau màu trăng sữa, mặt trước tùy theo thứ loài do quá trình lai tạo tự nhiên, có nhiều màu biến đổi từ nâu đỏ, sôcôla, đến vàng xanh. Hạc đỉnh là một trong những cây lan nhiệt đới đầu tiên nở hoa Ở Châu Âu.

Đây là loại lan hoàn toàn chịu ầm, điều kiện sinh thái tự nhiên là các vùng đầm lầy, vì thế khi bị úng nước ở giá thể sẽ không làm cây chết. Hạc đỉnh có thể trồng được ở vùng Á nhiệt đới và vùng nóng, nhiệt độ thích hợp cho nó từ 10oC – 25oC.

Tuy nhiên ở vùng nguyên quán Cao Nguyên Nam Trung Bộ, Hạc đỉnh trổ hoa vào tháng 1-2, và nếu được trồng ở thành phố HỒ Chí Minh, cây lan lại ra hoa vào tháng 3. ánh sáng cần thiết từ 8.000-15.000 1nl/m2. Hạc đỉnh là loại lan duy nhất trong giống có thể kinh doanh trên phương diện thương mại thường dùng dưới dạng hoa cất. Dù rằng hoa Hạc đỉnh rất bền, chơi được từ 1-2 tháng, hoa đẹp và có mùi thơm, nhưng khuyết diềm của loài này là nếu va chạm cành hoa dù nhẹ cũng gây phản ứng sinh hóa, tạo ra những vết sẹo màu đen rất xấu.

Phải cẩn thận khi di chuyển cây lan Hạc đỉnh đang có hoa. Muốn ngừa khuyết diềm trên, nếu cây Hạc đỉnh trồng ở nơi xa trên vài trăm cây số, phải di chuyển Hạc đỉnh đến nơi trưng bày từ khi phát hoa còn rất ngắn (O,5m). Hai tháng sau khi nuôi dưỡng trở lại, những vết sẹo màu đen sẽ mất hán, cây sẽ trổ hoa rất đẹp không khác gì cây bình thường. Hạc đỉnh là loài lan đất nên giá thể gồm 2 phần tro trấu, 1 phần đất mùn + 1 phần phân bò hoại + l/20 bánh dầu xay nhuyễn có thể tưới thêm phân 30-10-10, tưới 2 lần/tuần trong suốt mùa tăng trưởng. Suốt năm nước được tưới 1 ngày 3 lần.

Chỉ trừ 1 tháng sau khi hoa trổ, cho cây nghỉ hoàn toàn không tưới. Một giá thể khác tỏ ra hữu hiệu hơn: một phần tro trấu + 1 phần rơm mục + 1 phần phân bò hoại + 1/20 bánh dầu xay nhuyễn. Lan Hạc đỉnh có thể nhân giống đơn giản bằng 1 giả hành như Cymbidium. Tuy nhiên với số lượng giả hành càng nhiều cây càng tăng trưởng mạnh, tối thiểu là 3 giả hành để đảm bảo cho cây ra hoa trong mùa tới.

Ngoài ra cây Hạc đỉnh còn có thể nhân giống bằng phát hoa như một số loài thuộc giống Phalaenopsis, khả năng phát triển của cây con trên mỗi đốt của phát hoa rất mạnh. Khi Hạc đỉnh vừa tàn, ta cất phát hoa lìa khói giả hành và nhúng vào parafin đặt nằm ngang trên mặt cát hay luồn trong các đám cỏ dại hoặc bất cứ nơi nào có ẩm độ 100% với ánh sáng yếu 30%.

Sau thời gian chừng 3 tháng, hầu như mỗi đốt của phát hoa đều mọc một cây con, trong khi đó trục sẽ thối dần. Lúc ấy ta đem trồng từng cây vào các chậu tương xứng với giá thể như đã nói trên và cây sẽ ra hoa sau thời gian 4 năm. Hạc đỉnh ít bị sâu bệnh, thường bị sâu ăn lá và các loại cào cào cắn phá. Đây là loài hoa rất lý tưởng để trang trí các phòng khách, phòng họp có không gian rộng.


【#10】Lan Hoàng Thảo Kèn, Loài Phong Lan Đẹp Cần Được Bảo Tồn

Hoàng thảo kèn là một loài phong lan rất đẹp và luôn là niềm đam mê của gới chơi lan. Tuy nhiên, loài lan này ngày càng trở nên quý hiếm và việc chăm sóc lan không đúng cách cũng là một phần nguyên nhân khiến cho lan chết, dẫn đến nguy cơ bị tuyệt chủng cao. Chính vì vậy cách trồng và chăm sóc đúng kỹ thuật là một yếu tố quan trọng mà những người chơi lan cần phải nắm được cũng như tuân thủ nghiêm ngặt. Vườn Chim Việt, bằng kinh nghiệm lâu năm của mình sẽ chia sẻ kinh nghiệm về cách trồng và chăm sóc Hoàng Thảo Kèn.

Hoàng Thảo Kèn là loài lan rất quý hiếm

Hoàng Thảo Kèn có tên khoa học là Dendrobium Lituiflorum. Đây là một trong số những loại lan rất đẹp và quý hiếm. Ngoài tự nhiên chúng bị săn lùng nhiều dẫn đến nguy cơ tuyệt chủng. Một số nơi đã đưa Hoàng thảo kèn vào diện cần được bảo vệ. Ở nước ta rất may mắn có loài lan này, nhưng nếu không có biện pháp bảo vệ thì cũng có nguy cơ bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên. Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu việc nuôi cấy mô đại cho loài lan này để giảm bớt sự săn lùng ngoài tự nhiên.

Một số nơi đã đưa Hoàng thảo kèn vào diện cần được bảo vệ

Căn cứ đặc tính phát triển của cây, thời điểm tốt nhất để trồng và khai thác lan Hoàng Thảo Kèn là thời điểm từ tháng Giêng cho đến đầu tháng 3 (theo âm lịch).

Cách sơ chế ban đầu: Cây mới lấy về được cắt sạch rễ và nhúng vào nước vôi trong, sau đó đem treo lên 2 đến 3 ngày cho quen với môi trường xung quanh.

Giá thể ghép: Nên ghép vào gỗ lũa (loại gỗ có bề mặt mềm và xốp) là chuẩn nhất, sau khi ghép treo lan lên cao nơi thoáng gió và tránh nắng trực tiếp.

Ghép đúng cách: Lưu ý với cây mới nên cắt hết rễ cũ trước khi ghép (không nên tiếc vì bộ rễ cũ gần như đã hỏng khi ta lột chúng khỏi giá thể cũ). Ghép đúng cách là thân mẹ phải hướng lên trên trừ khi thân cây quá dài và nặng không thể hướng hoàn toàn lên trên được. Ghim chắc chắn cả khóm lan vào giá thể tránh xê dịch ảnh hưởng đến sự phát triển ban đầu của rễ mới.

Ngoài thời kỳ trên thì việc khai thác và trồng cũng nên được xem xét và tiến hành vào thời kỳ sau khi lan Hoàng Thảo Kèn bước vào giai đoạn nghỉ đông và thân cây đã có sự phát triển hoàn chỉnh. Chúng ta cũng tiến hành các bước sơ chế Hoàng Thảo Kèn như trên. Tuy nhiên, chúng ta chỉ nên tưới từ 1 đến 2 lần một tuần, tránh cho cây ra rễ mọc mầm trái vụ hoặc làm cho thối thân mẹ sẽ ảnh hưởng đến chất lượng hoa. Thời điểm ghép giò thích hợp vào tháng 11 âm lịch khi thời tiết lạnh.

Cây mới lấy về được cắt sạch rễ và nhúng vào nước vôi trong, sau đó đem treo lên 2 đến 3 ngày cho quen với môi trường xung quanh

Chăm sóc lan Hoàng Thảo Kèn đúng cách

Hoàng thảo kèn mới đem ở rừng về, trường hợp lan đang có nụ thì không vội ghép ngay, đầu tiên hãy treo ngược lên khoảng 2 ngày (lưu ý không tưới nước và không bón phân). Sau đó mới cắt rễ cách gốc khoảng 2 cm rồi mới đem đi ghép.

Cách tưới nước: Chỉ được tưới nước 2 lần trong 1 tuần đủ cho ẩm gốc, nếu là trời mua phùn thì bỏ không cần tưới nước. Tuy nhiên cũng cần căn cứ cụ thể cho từng loại giá thể và vào thời tiết cụ thể để có chế độ tưới nước tốt nhất. Độ ẩm của gốc không được quá 6 đến 8 tiếng trong một ngày. Vào mùa đông là lúc lan nghỉ ngơi nên chỉ tưới khi thấy cây bị teo hay héo.

Cách bón phân: Sau mùa cho hoa thì lan sẽ bước vào giai đoạn tăng trưởng phát triển, các chồi non cũng bắt đầu mọc lên từ gốc, phân bón tốt nhất nên dùng là phân NPK tỷ lệ 30-10-10 hay có thể cân đối dùng NPK tỷ lệ 20-20-20 hàng tuần, cần pha loãng hơn liều lượng ở trên chai để phun, có thể bổ sung thêm B1 nếu cần thiết. Đến giai đoạn lập xuân thì bón thêm phân để kích hoa theo tỷ lệ 10-30-10 cho đến khi lan nhú nụ thì dừng.

Cách phòng ngừa sâu bệnh:

+ Cần lưu ý kiểm tra liên tục xem cây có bị sâu bọ xâm hại hay không để có biện pháp phòng trừ kịp thời.

+ Bệnh: Các bệnh hay gặp vào mùa hè như là thắt gốc, thối nón, vàng lá, đốm lá, hay thối nhũn do thời tiết nắng nóng, sau đó là mưa thất thường. Cách phòng trách là sau khi trời mưa rồi lại nắng thì cần phải đưa lan ra chỗ thoáng gió, chỗ gió lùa mạnh, và cần tránh ánh nắng. Ở giai đoạn này cần phải phun thuốc chống thối 2 đến 3 lần trong một tháng (có thể dùng thuốc trị nấm như ridomil).

Vườn Chim Việt, địa chỉ bán lan Hoàng Thảo Kèn đẹp, chất lượng, giá cả tốt

Nếu bạn có nhu cầu cần tư vấn về cách trồng, chăm sóc hoặc mua cây Hoàng Thảo Kèn thì hãy đến với Vườn Chim Việt. Tại đây, chúng tôi có hàng trăm giống lan khác nhau, đa dạng về chủng loại, đảm bảo chất lượng và giá thành hợp lý chắc chắn sẽ đáp ứng tất cả các nhu cầu về lan của bạn.


Done

Bạn đang xem chủ đề Lan Trầm Rừng Vàng trên website Inkndrinkmarkers.com. Hy vọng những thông tin mà chúng tôi đã chia sẻ là hữu ích với bạn. Nếu nội dung hay, ý nghĩa bạn hãy chia sẻ với bạn bè của mình và luôn theo dõi, ủng hộ chúng tôi để cập nhật những thông tin mới nhất. Chúc bạn một ngày tốt lành!

Chủ đề mới hơn

Trồng Lan Trầm Tím - Xem 1,584

Gia Lan Tram Huong - Xem 1,881

Cay Phong Lan Tram - Xem 1,584

Gia Phong Lan Tram - Xem 2,079

Hoa Phong Lan Tram - Xem 1,881

Bán Phong Lan Trầm - Xem 1,683

Xem Phong Lan Tram - Xem 1,089

Lan Tram Huong Rung - Xem 1,881

Phong Lan Tram Rung - Xem 1,089

Phong Lan Tram Thai - Xem 1,782

Chủ đề cũ hơn

Lan Trầm Môi Tuyết - Xem 1,782

Phong Lan Trầm Lùn - Xem 1,485

Phong Lan Trầm Lai - Xem 990

Lan Trầm Hồng Ngọc - Xem 1,584

Cây Lan Trầm Hương - Xem 1,881

Bán Lan Trầm Trắng - Xem 2,673

Xem Lan Tram Huong - Xem 1,782

Phong Lan Tram Lao - Xem 1,584

Nhu Lan Tram Huong - Xem 1,584

Giong Lan Tram Tim - Xem 2,277