--- Bài mới hơn ---
Nhân Giống Lan Hài Đỏ Paphiopedilum Delenatii
Phát Triển Cây Giống Năng Suất Cao Từ Công Nghệ Nuôi Cấy Mô Thực Vật
Kinh Nghiệm Trồng Lan Hài
Bí Kíp Trồng Lan Hài Hiệu Quả Cho Người Mới Nhập Môn
Khám Phá Vẻ Đẹp Mới Lạ Của Lan Hài Vân Bắc
Nhân giống invitro lan Hài Paphiopedilum:
Paphiopedilum là một trong những loài lan nổi tiếng và cũng khá hiếm. Các thành viên của loài này được bán và trưng bày dưới dạng chậu cây cảnh và hoa cắt cành. Các quần thể hoang dã của Paphiopedilum đang bị đe doạ bởi sự tuyệt chủng do sự khai thác quá mức và mất môi trường sống thích hợp.
Xem tất cả bài viết vềinvitro Hoa Lan
Việc giảm giá trị thương mại thông qua việc nhân giống trong ống nghiệm với quy mô lớn là một giải pháp để giảm áp lực từ việc khai thác bất hợp pháp, cố gắng đáp ứng các nhu cầu thương mại và thiết lập lại các loài bị đe doạ để đưa trở lại hoang dã. Mặc dù Paphiopedilum được nhân giống thương mại hóa thông qua việc nảy mầm không cộng sinh, nhưng vẫn được xem là khó nhân giống in vitro, đặc biệt là sự tái sinh cây con từ nuôi cấy mô. Đánh giá này nhằm mục đích đề cập đến các khía cạnh quan trọng nhất và cập nhật nghiên cứu tiến bộ trong nhân giống in vitro Paphiopedilum đồng thời nhấn mạnh tầm quan trọng của việc cải tiến thêm các quy trình nuôi cấy mô từ các mẫu cấy ex vitro.
Giới thiệu phương pháp nhân giống in-vitro Lan Hài Paphiopedilum
Paphiopedilum Pfitzer (Orchidaceae) thường được biết đến là lan hài vì hoa của chúng có hình cái túi giống như chiếc hài của phụ nữ. Các thành viên của chi này là một trong những loài hoa lan phổ biến nhất và được thương mại hóa dưới dạng những chậu hoa kiểng và hoa cắt cành vì chúng có rất nhiều hình dạng hoa, kích cỡ và màu sắc, đã thu hút sự quan tâm của nhiều người trồng lan và những người chơi lan. Paphiopedilum là một trong những giống lan phổ biến và hiếm được bán và trưng bày ngày nay (Cribb, 1998, Liu và cộng sự, 2009, Sheehan & Sheehan, 1994). Chi Paphiopedilum có khoảng 96-100 loài và phạm vi phân bố của nó trải dài từ phía đông Ấn Độ qua miền Nam Trung Quốc đến Philippines, Đông Nam Á và quần đảo Mã Lai đến New Guinea và quần đảo Solomon (Cribb, 1998; Liu và cộng sự, 2009, World Checklist of Selected Plant Families, 2014, Wu và cộng sự, 2009). Các quần thể tự nhiên đang bị đe doạ bởi sự tuyệt chủng do hậu quả của việc khai thác quá mức và mất môi trường sống thích hợp, và tất cả các loài Paphiopedilum được liệt kê trong Công ước về thương mại quốc tế các loài động, thực vật hoang dã nguy cấp (CITES) Phụ lục I. Theo CITES, việc buôn bán các loài này là bị cấm (Zeng và cộng sự, 2012).
Đến nay đã có 75 nghiên cứu được báo cáo về sự nhân giống in vitro các loài Paphiopedilum và cây trồng, trong đó có gần 32 loài bản địa và hơn 30 giống lai. Tuy nhiên, có 58 nghiên cứu được báo cáo cho sự nảy mầm bằng hạt và hình thành PLB (Protocorm Like Bodies: thể tiền chồi) sau đó. Hầu hết các mẫu nuôi cấy của quá trình vi nhân giống Paphiopedilum được sử dụng có nguồn gốc từ nguyên vật liệu in vitro của giống lai Paphiopedilum và chỉ có ba báo cáo có nguyên vật liệu nguồn gốc từ các mẫu cấy ex vitro.
Sự nảy mầm không cộng sinh
Cho đến gần đây, do sự hạn chế trong các quy trình nuôi cấy mô, sự nhân giống thương mại Paphiopedilum của người trồng vẫn còn hoàn toàn thông qua việc nảy mầm không cộng sinh (Hong và cộng sự, 2008). Sự nảy mầm không cộng sinh từ hạt giống Paphiopedilum trưởng thành thường gặp nhiều khó khăn và khác biệt (Pierik et al., 1988, Stimart & Ascher, 1981). Sự nẩy mầm và phát triển của hạt Paphiopedilum chịu ảnh hưởng đáng kể bởi một số yếu tố, bao gồm sự trưởng thành của hạt, tiền xử lý hạt, thành phần môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy và phương pháp nuôi cấy. Một số kết quả thí nghiệm, chẳng hạn như tỷ lệ nảy mầm của hạt giống của cùng một loài trên cùng một môi trường, đã được chứng minh là không nhất quán, ví dụ tỷ lệ nảy mầm của 120 ngày sau khi thụ phấn (DAP) của hạt P. armeniacum là 25.2% (Chen và cộng sự, 2004b) và 18.4% (Ding và các cộng sự, 2004) trên môi trường Robert Ernst (RE, Arditti và cộng sự, 1982).
Sự nảy mầm từ hạt và sự phát triển mầm đốt thân của Paphiopedilum
Sự nảy mầm, tăng trưởng của cây con và sự phát triển trong ống nghiệm của Paphiopedilum thường được chia thành 5 giai đoạn: (1A-F, Zeng và cộng sự, 2012): (1) quá trình tách vỏ hạt giống bằng cách phình to của phôi (quá trình nảy mầm); (2) sự xuất hiện của chồi (mô phân sinh non) và/hoặc rễ giả; (3) sự xuất hiện và sự kéo dài của lá thứ nhất; (4) sự hiện diện của một lá và một hoặc nhiều rễ; (5) sự hiện diện của hai hoặc nhiều lá và rễ, hình thành cây con. Tốc độ nảy mầm có thể đơn giản được tính trong mỗi giai đoạn phát triển (tức là mỗi đơn vị thời gian) bằng cách chia số lượng hạt cho số lượng các mầm đốt thân.
Ảnh hưởng của hạt giống trưởng thành và quá trình tiền xử lý đối với sự nảy mầm không cộng sinh
Ở hoa lan, phôi hợp tử biệt hóa rất kém, và những mô phân sinh và lá mầm thường không có mặt tại thời điểm sự phát tán hạt (Yeung và cộng sự, 1996). Hiện nay, thông tin về sự phát triển phôi ở các loài Paphiopedilum là rất hạn chế, và chỉ có một vài báo cáo về P. insigne (Nagashima, 1982, Zinger & Poddubnaya-Arnoldi, 1966), P. godefroyae (Ren & Wang, 1987), P Delenatii (Lee và cộng sự, 2006) và P. hirsutissinum, P.appletonianum và P. armeniacum (Zhang và cộng sự, 2013). Những quan sát quan trọng và chi tiết được thực hiện bởi Lee et al. (2006), người phát hiện rằng thụ tinh xảy ra ở khoảng 60 và 75 DAP, hợp tử và mầm phôi có thể được quan sát trong các túi nang, mặc dù kết quả không được định lượng. Trong giai đoạn đầu của hình dạng cầu (90 DAP), sự phân chia tế bào bổ sung đã xảy ra ở lớp bên trong cũng như lớp bề mặt, dẫn đến sự phát triển của phôi hoàn thiện. Tầng nguyên bì rõ rệt đã được tìm thấy ở khoảng 105 DAP, khi 105 DAP, những bào quan nhỏ với các hạt tinh bột, ty thể, lipid và những không bào nhỏ đã được nhìn thấy dễ dàng trong các tế bào của phôi hoàn thiện. Khi phôi đạt đến giai đoạn hình cầu hoàn toàn (150 DAP), hoạt động phân bào ngừng lại. Một lượng lớn không bào trong tế bào chất giảm xuống và tế bào chất trở nên đậm đặc. Lớp vỏ hạt có nguồn gốc từ các tế bào bên trong và bên ngoài của noãn. Các tế bào của các lớp bên trong của vỏ hạt đã hình dạng mảnh mai, trong khi các lớp bên ngoài lại rộng hơn. Trong giai đoạn hình cầu của phôi (150 DAP), lớp ngoài của vỏ bắt đầu co lại và teo lại dần dần, và lớp biểu bì bao phủ toàn bộ phôi và vỏ bên trong noãn và phôi, tạo ra một hàng rào không thấm nước và sự hấp thu chất dinh dưỡng ở hạt giống P. delenatii trưởng thành. Giống như các loài lan khác, không thấy nội nhũ vì vỏ hạt của hầu hết cây lan thường xuất phát từ phần ngoài (Yeung và cộng sự, 1996) mặc dù vỏ hạt của P. delenati có nguồn gốc từ cả phần tế bào bên trong và bên ngoài. Ngoài ra, các hình thái đặc trưng của tế bào vận chuyển và không có lớp biểu bì trong thành tế bào sợi treo đã chứng minh giả thiết rằng sợi treo là điểm hấp thụ dinh dưỡng chính cho phôi phát triển ở P. delenatii (Lee và cộng sự, 2006).
Dưới các điều kiện nảy mầm thích hợp, phôi hoàn toàn hình thành và vỏ hạt có thể không bị hóa gỗ, cho phép nó có thể thẩm thấu được nước và các chất dinh dưỡng. Hạt 90-DAP chưa trưởng thành của Paphiopedilum wardii không nảy mầm và hóa nâu ngay sau khi cấy và hạt 120-DAP cần khoảng thời gian dài hơn 150-DAP để nảy mầm hoặc để trưởng thành hơn, cho thấy rằng những noãn lan còn non không thích hợp cho sự nảy mầm và có thể cần thời gian cho sự hình thành bộ phận hoặc tổng hợp các chất dinh dưỡng hoặc để giúp phôi nhận ra các chất kích thích có trong môi trường, do đó cho phép chúng nảy mầm (Nhut et al., 2005, Zeng và cộng sự, 2012). Ngoài ra, phôi có thể kém phát triển để hấp thụ chất dinh dưỡng từ môi trường (Long và cộng sự, 2010). 180 hạt DAP của P. wardii có thể nảy mầm tốt nhờ sự huy động protein hiệu quả trong quá trình bù nước và vỏ phôi chưa phát triển (Bảng 1, Rasmussen, 1995, Zeng và cộng sự, 2012). Một số yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ nảy mầm của hạt Paphiopedilum trưởng thành: vỏ hạt không thấm nước (Van Waes & Debergh, 1986a), sự có mặt của các chất ức chế hóa học như abscisic acid (ABA), hoặc thiếu hormone kích thích sự nẩy mầm (Van der Kinderen, 1987). Trong các điều kiện nảy mầm thích hợp, phôi bào tử của hầu hết các hạt trưởng thành hoàn toàn và vỏ hạt có thể không bị hóa gỗ, cho phép nó có thể thẩm thấu được nước và các chất dinh dưỡng trong khi các hạt trưởng thành có thể có khả năng nhân giống và bảo quản lớn hơn do lớp vỏ hạt đã hoàn thiện và lượng nước thấp hơn (Miyoshi & Mii, 1998, Zhang và cộng sự, 2013).
Sự nảy mầm của hạt Paphiopedilum và sự phát triển mầm đốt thân được kích thích bằng phương pháp tiền xử lý phù hợp, bao gồm natri hypochlorite (NaOCl) hoặc NaOH (Lee, 2007, Liao & Chen, 2006, Zeng và cộng sự, 2012). Loại, nồng độ của dung dịch tiền xử lý và thời gian tiền xử lý là những yếu tố chính. Zeng và các cộng sự (2012) báo cáo rằng việc xử lý trước hạt giống P. wardii (360 DAP) với dung dịch NaOCl có chứa 0.5% Clo trong 60 phút hoặc 1.0% Clo trong 40 phút làm tang đáng kể tỷ lệ nảy mầm (70.33 và 67.67%) so với các phương pháp tiền xử lý khác và việc kiểm soát (dung dịch 0.1% HgCl2) và tất cả phương pháp tiền xử lý đã rút ngắn đáng kể thời gian cho sự nảy mầm. Việc tiền xử lý bằng NaOCl, NaOH hoặc Ca(OCl)2 có thể đã ăn mòn vỏ hạt và tăng tính thẩm thấu của hạt với oxy và các chất dinh dưỡng (Major & Wright, 1974, Rasmussen, 1995 Van Waes & Debergh, 1986 a, b), trong khi các chất ức chế như ABA có thể bị giảm trong hạt (Lee, 2007, Van der Kinderen, 1987). Tỷ lệ nảy mầm của hạt thấp hoặc không nảy mầm có thể là vì hạt bị hư hại do thời gian xử lý với NaOCl quá dài (Kaneko & Morohashi, 2003).
Hình 1. Nuôi cấy in vitro, phát triển cây con và đưa Paphiopedilum wardii Sumerh trở lại môi trường tự nhiên. (A) giai đoạn 0, hạt giống, không nảy mầm. (B) Giai đoạn 1, tvỏ hạt bị vỡ. (C) Giai đoạn 2, xuất hiện của rễ giả. (D) Giai đoạn 3, sự xuất hiện và sự kéo dài của lá thứ nhất. (E) Giai đoạn 4, một lá và xuất hiện rễ. (F) Giai đoạn 5, có hai hoặc nhiều lá. (G) Sự nảy mầm không cộng sinh trên môi trường 1/2 MS được bổ sung với NAA 0.5 mg/L, 10% CW (v/v) và 1.0 g/L AC. (H) và (I) Phát triển cây con trên môi trường Hyponex N026 bổ sung với NAA 1.0 mg/L, 10% CW và 1.5 g/L AC. (J) Sự phát triển của cây con trên môi trường Hyponex N016 chứa 1.0 mg/L NAA, 50 g/L BH và 1.5 g/L AC. (K) Cây hoa từ cây con in vitro trong nhà kính. (L) Thiết lập các cây con in vitro trong 12 tháng sau khi tái giới thiệu.
Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sự nảy mầm không cộng sinh
Ảnh hưởng của môi trường cơ bản và pH
Bảng 1. Ảnh hưởng của mức độ trưởng thành hạt giống của Paphiopedilum lên sự nảy mầm trong ống nghiệm.
Xem ở bài viết gốc: https://khonggiansinhhoc.com/nhan-giong-vitro-lan-hai-paphiopedilum/
Tác động của nhiều môi trường khoáng chất cơ bản đã được thử nghiệm trên sự nảy mầm in vitro của hạt Paphiopedilum. Sự nảy mầm của hạt và phát triển cây con của Paphiopedilum bị ảnh hưởng mạnh bởi thành phần khoáng chất của môi trường cơ bản (Bảng 2). Hầu hết các loài Paphiopedilum thích môi trường khoáng thấp để nảy mầm hạt và sự ức chế nảy mầm của Paphiopedilum trên môi trường Murashige và Skoog (MS, Murashige & Skoog, 1962) có thể là do hàm lượng khoáng cao (Chen et al., 2004a; Ding et. Al., 2004, Long et al., 2010, Pierik và cộng sự, 1988), như là 1/2, 1/4, 1/6, 1/5 hoặc 1/8 MS (nghĩa là /2, 1/4, 1/6, 1/5 hoặc 1/8 lượng chất dinh dưỡng vi chất và vĩ mô) đã được chứng minh phù hợp hơn (Ding và cộng sự, 2004, Lee & Lee, 1999, Zhou và cộng sự, 2013).
Môi trường lý tưởng cho sự nảy mầm của cùng một loài Paphiopedilum là khác nhau. Ví dụ, Nhut et al. (2005) báo cáo hạt giống 9 tháng tuổi của P. delenatii được nuôi cấy trên môi trường Knudson C (KC) (Knudson, 1946), là tối ưu cho sự nảy mầm in vitro so với môi trường MS hoặc 1/2 MS. Tương tự, đối với P. wardii cho thấy sự nảy mầm là thấp hơn đáng kể trên môi trường MS so với môi trường MS 1/2 (Zeng et al., 2012). Tuy nhiên, khoáng chất không phải là yếu tố duy nhất ảnh hưởng đến sự nảy mầm của P. wardii bởi vì tỷ lệ nảy mầm của hạt thấp hơn đáng kể ở môi trường 1/4 MS – chứa hàm lượng khoáng chất thấp hơn so với môi trường 1/2 MS. Tuy nhiên, thành phần môi trường chính xác và tỷ lệ các khoáng chất khác nhau cũng có một ảnh hưởng đáng kể đến sự nảy mầm hạt P. wardii và phát triển cây con của P. wardii. Chẳng hạn, sự nảy mầm của hạt giống cao nhất là trên môi trường Vacin và Went (VW, Vacin & Went, 1949), nhưng chỉ có 14% mầm đốt thân phát triển thành cây con ở giai đoạn 5, thấp hơn đáng kể so với môi trường 1/2 MS và Hyponex N026, trong đó 52% các mầm đốt thân ở giai đoạn 2 đã chết (Zeng và cộng sự, 2012).
Pierik et al. (1988) báo cáo sự nảy mầm của P. ciliolare cao nhất trên môi trường KC và 1/4 MS và thấp hơn nhiều trên môi trường MS; KC dẫn đến cái chết của thực vật. Môi trường Thomale GD1 (Thomale, 1954) được sửa đổi đã cho thấy sự phát triển mầm đốt thân và tăng trưởng cây non cao hơn môi trường 1/4 MS. Sự nảy mầm của hạt P. ciliolare thấp hơn đáng kể trên môi trường 1/4 MS, mà chứa 3/4 hoặc toàn bộ muối vi lượng (trừ sắt) so với môi trường không có vi chất dinh dưỡng, nhưng sự nảy mầm của P. ciliolare không khác biệt đáng kể ở 1/4 MS chứa 1/4-, 1/2-, 3/4- hoặc toàn bộ các chất dinh dưỡng vi lượng. Sự nảy mầm của P. ciliolare không ảnh hưởng đáng kể bởi nồng độ NaFeEDTA, ở nộng độ 25 mg/L là tối ưu. Sự phát triển của cây được thúc đẩy mạnh mẽ bởi sắt, và tất cả các mầm đốt thân và cây con chết trong quá trình xử lý ánh sáng trong môi trường không chứa sắt.
Trong hầu hết các nghiên cứu Paphiopedilum, sự nảy mầm của hạt có thể đạt được ở pH 5.0-6.0 (Ernst, 1975, 1980, Fast, 1971, Flamee, 1978; Thomale, 1957, Zeng và cộng sự, 2012). Pierik et al. (1988) báo cáo rằng pH (5.5, 6.0, 6.5 và 7.0) của môi trường hầu như không ảnh hưởng đến sự nảy mầm của P. ciliolare, phản ứng tốt hơn ở pH 5.5 và 6.0, mặc dù không đáng kể, so với pH 6.5 và 7.0 . Hơn nữa, phát triển dưới ánh sáng rõ ràng là tốt hơn ở pH thấp, và pH 7.0 gây ức chế mạnh mẽ đến sự phát triển của cây con (Pierik và cộng sự, 1988).
Nguồn carbon
Carbohydrate như một nguồn năng lượng trong môi trường nuôi cấy vừa và chất thẩm thấu có ảnh hưởng đáng kể đến sự nảy mầm của Paphiopedilum và sự phát triển mầm đốt thân. Sự nảy mầm của hạt Paphiopedilum không xảy ra nếu không có đường (Fast, 1971, Pierik và cộng sự, 1988). Sucrose là nguồn carbon sử dụng nhiều nhất cho sự nảy mầm của cây lan Paphiopedilum (Chen và cộng sự, 2004a, Ding và cộng sự, 2004, Hossain và cộng sự, 2013, Zeng và cộng sự, 2012). Tuy nhiên, các nguồn carbon khác bao gồm glucose, fructose, maltose và mannitol, cũng được sử dụng trong một số nghiên cứu (Long et al., 2010 Pierik et al., 1988). Pierik et al. (1988) báo cáo rằng sự nẩy mầm cao nhất (48%) trên môi trường Thomale đã biến đổi với nồng độ đường thấp nhất (0.5% glucose + 0.5% fructose), cao hơn đáng kể so với môi trường với 1.0% glucose + 1.0% fructose (37%) hoặc trên môi trường có 1.25% đường glucose + 1.25% fructose (29%), nhưng không cao hơn đáng kể so với môi trường 0,75% glucose + 0.75% fructose (41%). Long et al. (2010) báo cáo tỷ lệ nảy mầm cao hơn đáng kể (19%) của P. villosum var. densissimum trên môi trường bổ sung 2 g/L glucose so với môi trường bổ sung 2 g/L sucrose, hoặc môi trường bổ sung maltose 2 g/L hoặc malnose (0.08%). Maltose là một nguồn đường hiệu quả cho sự tăng trưởng của cây Oncidium “Vũ nữ” (Jheng et al., 2006) mặc dù Long et al. (2010) nhận thấy rằng maltose ít hiệu quả hơn glucose hoặc sucrose trong việc thúc đẩy sự nảy mầm của Paphiopedilum.
Chất điều hòa tăng trưởng thực vật
Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật khác nhau có những ảnh hưởng khác nhau đến sự nảy mầm của các loài lan khác nhau (Teixeira da Silva, 2013a). Hầu hết hạt giống Paphiopedilum có thể nảy mầm bình thường khi không có PGR( plant growth) ngoại sinh. Hegarty (1955) đã quan sát tác động kích thích của indolo-3-butyric acid (IBA) đối với sự nảy mầm của giống lai Paphiopedilum, Pierik et al. (1988) cũng nhận thấy auxin (0,001-1,0 mg/L indolo-3-acetic acid (IAA) và 0.001-1.0 mg/L IBA] có tác dụng kích thích nhẹ, nhưng không có cytokinin và những hợp chất khác như PBOA (phenylboronic acid), đã được sử dụng để kích thích sự hình thành mô sẹo và PLB (Lin et al., 2000, Long và cộng sự, 2010, Luan và cộng sự, 2012, Stewart & Button, 1975). PGRs phù hợp nhất là 2,4-D, TDZ hoặc sự kết hợp của chúng. Stewart & Button (1975) đã báo cáo rằng chồi đỉnh có thể tạo ra mô sẹo trên môi trường Heller (Heller, 1965) có chứa 1,0 mg/L 2,4-D có hoặc không có 0,5 mg/L BA. Lin và cộng sự (2000) báo cáo rằng mô sẹo toàn năng của một giống lai Paphiopedilum (P. callosum ” Oakhi ” P. lawrenceanum ” Tradition “) có thể được kích thích từ mầm đốt thân của hạt giống trên môi trường 1/2 MS bổ sung 1-10 mg/L 2,4-D và 0,1-1 mg/L TDZ trong bóng tối. Luan và cộng sự (2012) cũng báo cáo ở môi trường 1/2 MS bổ sung 10 mg/L 2,4-D và 0,1 mg/L TDZ là phù hợp nhất cho sự kích thích mô sẹo của P. delenatii và P. callosum. Trong nghiên cứu của Lin và cộng sự (2000), trên môi trường không có PGR, mô sẹo nuôi cấy cấp 2 cho thấy sự phát triển nhỏ và cuối cùng bị nâu và hoại tử. Các hiện tượng tương tự đã được quan sát thấy trong mô sẹo được duy trì trên môi trường chỉ chứa TDZ hoặc 2,4-D; các mô sẹo nuôi cấy cấp 2 bắt đầu tăng sinh và tăng trọng lượng, sau đó bị hóa nâu và hoại tử. Mô sẹo nuôi cấy trên môi trường chứa cả 2,4-D và TDZ tăng sinh tốt và sau đó được tái sinh trên môi trường được thiết lập để tái tạo cây con. Những môi trường được bổ sung với 5 mg/L 2,4-D và 1 mg/L TDZ đã được chọn làm môi trường duy trì tiêu chuẩn cho sự tăng sinh của mô sẹo toàn năng vì có tốc độ tăng trưởng tốt nhất. Mô sẹo toàn năng có thể phát triển trên môi trường duy trì này trong 3 năm mà không bị mất khả năng tái sinh chồi. Các mô sẹo đã phát triển, hình thành các PLBs và cuối cùng là các cây con mà có thể được chuyển vào chậu và phát triển tốt. Những mô sẹo nhỏ hình thành trên môi trường có chứa 1 mg/L 2,4-D hoặc 100 mg/L PBOA một mình, thì không tăng sinh và cuối cùng chết trong các lần nuôi cấy tiếp theo. Trong tất cả các sự kết hợp khác của PBOA và TDZ, đều không có sự hình thành mô sẹo. Chỉ một mình TDZ không thể kích thích mô sẹo. Tuy nhiên, những mẫu mô của thân, đầu rễ và lá của bất cứ cây lai Paphiopedilum nào (P. henryanum ‘# 19’ ‘P. philippinense’ ‘# 10’ ‘) cũng không tạo ra mô sẹo hữu hiệu khi được nuôi cấy trên các môi trường nói trên cũng như trên các môi trường nuôi cấy khác (Lin và cộng sự, 2000).
Hong và các cộng sự (2008) báo cáo rằng hạt giống từ quả nang xanh 5 tháng tuổi của một loài lan Maudiae, P. Alma Gavaert, có thể hình thành mô sẹo toàn năng trên môi trường 1/2 MS bổ sung với 22,60μM 2,4-D (5,0 mg/L) và 4,54 μM (1,0 mg/L) TDZ trong bóng tối. Mô sẹo được tăng sinh và duy trì mà không có bất kỳ hình thái học nào khác trên cùng một môi trường với khoảng thời gian 2 tháng nuôi cấy cấp 2 trong hơn 2 năm.
Ng & Saleh (2011) báo cáo sự kích thích của mô sẹo từ các mẫu mô đốt thân của của cây con P. rothschildianum in vitro được nuôi cấy trên 1/2 MS bổ sung 4 μM (0,86 mg/L) Kn và 2 g/L peptone. Các mô sẹo được kích thích có thể tăng sinh và hình thành PLBs từ bề mặt của mô sẹo tăng sinh khi được nuôi cấy cấp 2 trên cùng một môi trường. Số lượng trung bình cao nhất của PLB thứ cấp được tạo thành trên môi trường 1/2 MS bổ sung 4.0 μM (0.86 mg/L) Kn là 4.1 PLBs/ mẫu mô sau 8 tuần nuôi cấy. Ngược lại, việc bổ sung BA đã ức chế sự kích thích của sự hình thành PLB thứ cấp. PLBs thứ cấp tiếp tục tăng sinh và hình thành 9.5-12.1 PLBs/PLB thứ cấp sau khi nuôi cấy lần 2 trên môi trường 1/2 MS không PGR được bổ sung với 60 g/L BH.
Ng & Saleh (2011) đã thử nghiệm môi trường 1/2 MS với các nồng độ khác nhau của BH, PH và TH (tương ứng 15, 30, 45 hoặc 60 g/L) hoặc 5, 10, 15 và 20% CW trên sự hình thành PLB. Ở nồng độ 20% (v/v) CW là sự bổ sung hữu cơ hiệu quả nhất để tạo điều kiện cho sự hình thành PLB ở P. rothschildianum và sự biệt hóa thành các cây con sau đó.
Nhân chồi
Các PGR bao gồm auxin (2,4-D và NAA), cytokinin (BA, TDZ, zeatin và Kn) và các hợp chất khác như 2iP được sử dụng để nhân chồi. Huang (1988) đã báo cáo rằng chồi bất định và cây con có thể phát triển từ những đỉnh chồi của giống lai Paphiopedilum (P. philippinense P. Susan Booth) in vitro và môi trường MS bổ sung với 3.0 mg/L 2iP, 0.1 mg/L NAA, 30 mg/L adenine sulfate và 15% CW có hiệu quả cho sự hình thành và phát triển các mẫu mô vô trùng, trong khi môi trường MS có bổ sung 100 mg/L BA (mức BA này là độc đối với hầu hết các cây) có thể được dùng để nhân chồi bằng cách gia tăng phân nhánh ở nách (Huang, 1988, Wu và cộng sự, 2012).
Huang và cộng sự (2001) phát hiện ra rằng TDZ không hiệu quả hơn BA cho sự tăng sinh chồi và sự hình thành rễ của ba giống lai Paphiopedilum (P. philippinense x P. Susan Booth, P. bellatulum ” Big spot ” x P. Jo Ann Wine, P. micranthum x P. Glaucophyllum). Số lượng chồi giống lai Paphiopedilum tăng gấp đôi mỗi 12 tuần khi xử lý với 13 µM (2.93 mg/L) BA và NAA 1.6 µM (0.3 mg/L), trong khi đó TDZ ức chế sự tang sinh chồi của các giống lai tương tự. NAA cũng không có lợi cho sự hình thành chồi, nhưng hơi ức chế khi ở nồng độ cao nhất (1.0 mg/L).
Chen và cộng sự (2002) báo cáo rằng môi trường nuôi cấy 1/2 MS được bổ sung TDZ nồng độ 0.45 hoặc 4.45 µM (0.1 hoặc 1.0 mg/L), hoặc 4.52 hoặc 45.25 µM (1.0 hoặc 10.0 mg/L) 2,4-D, một mình hoặc kết hợp, có thể kiểm soát sự phát triển của quá trình nhân chồi từ các mẫu mô đốt thân của giống lai P. philippinense (PH59, PH60). Môi trường 1/2 MS bổ sung với sự kết hợp của 4.52 µM (1.0 mg/L) 2,4-D và 0.45 µM (0.1 mg/L) TDZ kích thích tỷ lệ phần trăm cao hơn của các mẫu mô với chồi và tăng số lượng chồi/mẫu mô nhiều hơn so với môi trường không có PGR ở giống lai PH59. Ở giống lai PH60, mặc dù tỷ lệ phần trăm của các mẫu mô tạo thành các chồi đã tăng lên đáng kể trên môi trường nuôi cấy 1/2 MS được bổ sung với 4.52 µM 2,4-D (1.0 mg/L) và 0.30 µM (0.1 mg/L) TDZ, số lượng chồi/mẫu mô cao nhất có thể đạt được với 4.52 µM (1.0 mg/L) 2,4-D, nhưng không có TDZ. Tuy nhiên, Luan và cộng sự (2012) cho thấy môi trường 1/2 MS được bổ sung 0.5 mg/L TDZ và 0.1 mg/L NAA là phù hợp nhất cho sự tăng sinh chồi nụ của P. delenatii và P. callosum.
Hong và các cộng sự (2008) đã báo cáo một quy trình thích hợp cho sự kích thích PLB của chúng tôi Gavaert từ mô sẹo có nguồn gốc từ hạt trên môi trường 1/2 MS với 2.69 µM (0.5 mg/L) NAA kết hợp với 0.45 µM (0,1 mg/L) TDZ. Khi chuyển sang môi trường 1/2 MS bổ sung NAA 26.85 µM (5.0 mg/L), trung bình đạt 4.4 PLB/chồi nụ được hình thành từ mỗi mẫu mô sau 120 ngày nuôi cấy. Nồng độ PGR thích hợp để nhân chồi là 4.65 µM (1.0 mg/L) Kn, mà trung bình có thể kích thích 3.0 chồi từ một chồi non duy nhất sau 60 ngày nuôi cấy.
Long và các cộng sự (2010) báo cáo rằng chiều dài và số lượng chồi của bốn loài Paphiopedilum spp. bị ảnh hưởng bởi nồng độ và sự kết hợp của cytokinin và auxins được thêm vào môi trường. Không có lợi thế bằng cách thay thế BA bằng TDZ cho kích thích sự hình thành chồi ở cả 4 loài. Một nồng độ BA tương đối cao làm tăng số lượng chồi ở P. villosum var. densissimum và P. armeniacum nhưng giảm số lượng chồi ở P. insigne. BA ở nồng độ 3.5 mg/L gây hoại tử lan rộng ở mẫu mô P. insigne. Cơ chế hình thành cơ quan cao nhất của Paphiopedilum spp. xảy ra với sự kết hợp khác nhau của cytokinin và auxin trong môi trường. Số lượng chồi cao nhất của P. armeniacum với 4.0 mg/L BA và 0.1 mg/L NAA, với 1.0 mg/L BA và NAA 0.5 mg/L đối với P. insigne, với 3.0 mg/L BA và 1.0 mg/L NAA hoặc với 6.0 mg/L BA và 0.1 mg/L NAA cho P. villosum var. densissimum và với 5.5 mg/L BA và 0.5 mg/L NAA cho P. bellatulum.
Nhut và các cộng sự (2007) đã báo cáo rằng TDZ kích thích ra chồi gây ra ở P. delenatii có hiệu quả hơn BA hoặc zeatin, với 75% các đoạn đốt thình thành các chồi khi nuôi cấy trên môi trường MS biến đổi bổ sung với 1.5 mg/L TDZ sau 30 ngày nuôi cấy. Khi các mẫu mô cấy được nuôi cấy trên môi trường MS biến đổi bổ sung với BA 2.0 mg/L hoặc 1.5 mg/L zeatin, 54.5 và 58% các mẫu mô, hình thành chồi tương ứng.
Liao và các cộng sự (2011) báo cáo rằng lát cắt ngang của các giống lai Paphiopedilum (P. Deperle và P. Armeni White) có thể kích thích chồi bất định và tái sinh thành toàn bộ cây trên môi trường MS biến đổi bổ sung với 4.43 µM (1.0 mg/L) BA và 4.52 µM (1.0 mg/L) 2,4-D, hoặc trên môi trường MS biến đổi bổ sung với 44.39 µM (10.0 mg/L) BA và 26.85 µM (5.0 mg/L) NAA. Liao và các cộng sự (2011) phát hiện ra rằng các phần của nụ hoa dài từ 1.5-3.0 cm P. Deperle có thể tạo ra chồi, nhưng chỉ có các phần của nụ hoa ≥ 2.5 cm từ P. Armeni White có thể tái sinh. Các quan sát bằng kính hiển vi cho thấy lá bắc nhỏ ở cuống hoa bao bọc một nụ hoa thu nhỏ mới mà phát triển thành nụ hoa hoàn chỉnh với các mô tương tự như mô phân sinh dạng vòm có thể dẫn đến sự kích thích của thực vật. Sự lặp lại mô hình này đã dẫn đến cấu trúc cụm hoa duôi bò cạp ở loài Paphiopedilum đa hoa, và không cho kết quả lặp lại như trên đối với một hoa đơn lẻ.
Nhut và các cộng sự (2005) báo cáo rằng trạng thái vật lý của môi trường (lỏng hoặc bán rắn) ảnh hưởng đáng kể đến sự hình thành chồi ở các cây con bị thương in vitro của P. delenatii. Khi không bị chìm hoàn toàn trong môi trường nuôi cấy, cây con bị thương có thể lấy thành phần dinh dưỡng và PGR dễ dàng hơn trong môi trường lỏng. Điều này đã kích thích sự biệt hóa của mô bị ảnh hưởng và kết quả là số lượng chồi/mẫu mô ra nhiều hơn từ những cây con bị thương in vitro của P. delenatii. Trong môi trường bán rắn có chứa NAA 0.5 mg/L, số lượng chồi được hình thành mới có xu hướng giảm (từ 2.3 đến 0 chồi/mẫu mô) khi nồng độ TDZ tăng lên (0.25-2.5 mg/L). Ngược lại, số lượng chồi được hình thành trong môi trường lỏng tăng lên (từ 1.2 đến 3.0 chồi/mẫu mô) đáng kể khi mức độ TDZ tăng lên. Kết quả cho thấy những ảnh hưởng của TDZ đối với các mẫu mô phụ thuộc đáng kể vào các tính chất vật lý của môi trường. Trên môi trường lỏng hoặc bán rắn chứa 0.5; 1.0 hoặc 3.0 mg/L TDZ, không có auxin NAA, ảnh hưởng của môi trường lỏng lên sự tái sinh chồi tốt hơn môi trường bán rắn. Khi TDZ được sử dụng ở mức 1.0 mg/L, số lượng chồi/mẫu mô được hình thành (5.2 chồi/mẫu mô) trong môi trường lỏng lớn gấp gần 5 lần so với môi trường bán rắn (1.1 chồi/mẫu mô) và lớn hơn hai lần (2.2 chồi/mẫu mô) so với môi trường có chứa auxin, cho thấy rằng auxin có thể đóng vai trò ức chế trong môi trường lỏng.
Nhut và các cộng sự (2005) thấy rằng không có chồi nào được hình thành trong kiểm soát việc xử lý với các chồi không bị thương trong ống nghiệm của cây con P. delenatii trong tất cả các loại môi trường thử nghiệm. Trung bình có 2.3 chồi khỏe mạnh thu thập được từ những cây con đã được nuôi cấy trên môi trường MS rắn có chứa 0.25 mg/L TDZ và NAA 0.5 mg/L, bước tạo vết cắt trên chồi là điều kiện tiên quyết cho sự hình thành chồi ở cây con. Các tế bào bị thương ở khu vực bị hư hỏng có thể đã phản ứng dễ dàng hơn với các tác nhân kích thích như PGRs nhất định có trong môi trường, cho phép biệt hóa thành những chồi bất định.
Ng và các cộng sự (2010) báo cáo rằng thể chồi có thể được kích thích thành công từ các mô đốt thân và mô chồi đơn của P. rothschildianum được nuôi cấy trên môi trường 1/2 MS không có PGRs và nitơ hữu cơ (kiểm soát). Số lượng thể chồi tăng thêm bằng cách bổ sung vào môi trường nuôi cấy với nitơ hữu cơ (peptone và tryptone-peptone). Số lượng chồi nhân nhiều nhất đã hình thành trên các mô đốt thân được nuôi cấy trên môi trường 1/2 MS và bổ sung 1.0 g/L peptone với trung bình 2.9 chồi/mẫu mô sau 16 tuần nuôi cấy; Tuy nhiên, số lượng chồi cao nhất được hình thành trên môi trường bổ sung với 2.0 g/L tryptone-peptone với trung bình 2.8 chồi hình thành trên mỗi mẫu chồi đơn. Ngược lại, peptone không kích thích hiệu quả sự hình thành thể chồi từ các mẫu chồi non, trừ ở nồng độ thấp (0.5 gg/L). Việc bổ sung một lượng peptone lớn hơn (1.0 và 2.0 g/l) đã ức chế sự hình thành thể chồi.
Kích thích rễ
Sự kích thích rễ dễ dàng đạt được trong quá trình nuôi cấy in vitro của Paphiopedilum, và có thể được thúc đẩy bằng cách bổ sung chất hữu cơ và/hoặc PGRs (Huang và cộng sự, 2001, Zeng và cộng sự, 2013). Hong và các cộng sự (2008) báo cáo rằng PGR thích hợp cho sự ra rễ là NAA 26.85 µM (5.0 mg/L). Huang và cộng sự (2001) thấy rằng sự ra rễ đã được tăng mạnh bởi 1.6 µM (0.3 mg/L) và NAA 5.4 mM (1.0 mg/L). Huang và cộng sự (2001) cũng báo cáo rằng CW và HC làm tăng sự hình thành rễ, 15% (v/v) CW và 1.0 g/L HC là phù hợp nhất. Sucrose là tốt hơn cho sự ra rễ so với maltose, sự ra rễ ít xảy ra ở tất cả các nồng độ maltose, trong khi sucrose tăng cường ra rễ ở 0.18 M (62 g/L), nhưng đã ức chế ra rễ ở nồng độ cao hơn (0.26 M hoặc 89 g/L).
Thiết lập chế độ chăm sóc ex vitro và vườn ươm
Các bình nuôi cấy có chứa cây con hoặc cây con Paphiopedilum vi nhân giống in vitro thường được chuyển sang điều kiện tự nhiên từ buồng nuôi cấy trong khoảng 1-2 tuần trước khi chúng được đưa ra vườn ươm, mà có thể tăng khả năng thích ứng với môi trường bên ngoài, điều này rất hữu ích cho các dự án đưa loài lan Paphiopedilum trở lại tự nhiên (Chen và cộng sự, 2004b, Zeng và cộng sự, 2012). Các môi trường nuôi cấy cho lan thường bao gồm những viên gạch vỡ, đá núi lửa, rong rêu, than bùn, đá Zhijing (có tính chất giữ nước tốt hơn đá bình thường), vỏ cây và các môi trường hỗn hợp khác. Trong môi trường nhà kính có độ ẩm không khí cao, khoảng 60% cây con P. villosum var. Densissimum sống sót trên nền giá thể than bùn với rêu (Long et al., 2010). Zeng và các cộng sự (2012) báo cáo rằng môi trường hỗn hợp hoặc là sự kết hợp cả hai (Norikane và cộng sự, 2013), có thể tạo điều kiện nảy mầm hạt giống và kích thích tạo sinh khối ở hoa lan, điều này có thể rất hữu ích cho việc nhân giống in vitro Paphiopedilum do tốc độ nhân giống in vitro và tăng trưởng chậm của Paphiopedilum. Tuy nhiên, vẫn chưa có báo cáo về phương pháp sử dụng đèn LEDs và làm giàu CO2 được áp dụng trên nuôi cấy in vitro của Paphiopedilum.
Thông tin liên hệ
SBC Scientific
Hotline: 0945677929
Email:[email protected]
Oleh Nuôi Cấy Mô Thực Vật
--- Bài cũ hơn ---
Bảo Tồn Lan Hài Việt Nam
Phân Tích Phong Lan Hạc Vỹ Và Các Giá Trị Ẩn Chứa Bên Trong
Tư Vấn Cho Bạn Về Loài Hoa Phong Lan Hạc Vỹ Có Những Đặc Thù Riêng Biệt Nào
Lan Hạc Vĩ Rủ Đẹp Như Trong Như Vườn Cổ Tích Ở Điện Biên
Cây Hoa Lan Hạc Vỹ: 7 Yếu Tố Quan Trọng Khi Chăm Sóc Cây Khỏe Mạnh