Can Mua Lan Kim Tuyen

Tổng hợp các bài viết thuộc chủ đề Can Mua Lan Kim Tuyen xem nhiều nhất, được cập nhật mới nhất ngày 18/01/2021 trên website Inkndrinkmarkers.com. Hy vọng nội dung bài viết sẽ đáp ứng được nhu cầu của bạn, chúng tôi sẽ thường xuyên cập nhật mới nội dung Can Mua Lan Kim Tuyen để bạn nhận được thông tin nhanh chóng và chính xác nhất. Cho đến thời điểm hiện tại, chủ đề này đã đạt được 1.683 lượt xem.

Có 67 tin bài trong chủ đề【Can Mua Lan Kim Tuyen】

【#1】Bán Cây Phát Tài Giá Rẻ Trực Tuyến Trên Bancaycanhdep.com

Bancaycanhdep.com Chuyên Bán Cây phát tài giá rẻ. Chúng tôi cung cấp tất cả các loại Cây phát tài giá sỉ và giá lẻ cho các công ty cây cảnh và khách hàng

Giá Cây phát tài. Cây phát tài giá bao nhiêu?

Hiện tại giá Cây phát tài đang áp dụng tại website chúng tôi quý khách có thể tham khảo nếu đặt loại khác có thể liên hệ trực tiếp với nhân viên chúng tôi

Giá các loại Cây phát tài

  • ⇔ Giá Cây phát tài để bàn: 40.000 VNĐ Giá chưa bao gồm chậu sứ
  • ⇔ Giá Cây phát tài khúc lớn: chậu gồm 5 thân cao 1m2 – 1m4: 480.000 VNĐ Giá chưa bao gồm chậu
  • ⇔ Giá Cây phát tài khúc nhỏ: chậu gồm 5 thân cao 1m: 380.000 VNĐ Giá chưa bao gồm chậu
  • ⇔ Giá Cây phát tài núi: 2.500.000 VNĐ Giá chưa bao gồm chậu
  • ⇔ Giá Cây phát tài lớn combo bao gồm chậu đĩa lót: 820.000
  • ⇔ Giá Cây phát tài lớn tặng khai chương combo bao gồm chậu đĩa lót: 880.000 VNĐ Giá bao gồm nơ + thiệp
  • ⇔ Giá Phát Tài Búp Sen thủy sinh : 200.000 VNĐ
  • ⇔ Giá Phát Tài Búp Sen :55.000 VNĐ
  • ⇔ Giá Cây phát tài gốc giá từ : 1.500.000 VNĐ
  • ⇔ Giá Cây phát tài gốc lớn : Quý khách có thể liên hệ theo số 0888834538

Cây phát tài hay còn gọi là cây thiết mộc lan, phát tài khúc với ý nghĩa mang lại may mắn cho gia chủ trong cuộc sống và công việc. Sản phẩm phù hợp với gia chủ muốn mua cây phòng khách, phòng hội họp, văn phòng công sở, nhà hàng, khách sạn, hoặc dùng làm quà tặng trong những dịp mừng lễ, tết, thăng chức, khai trương

Cây phát tài thuộc thực vật thường xanh, hình dáng tươi đẹp, lá xanh biếc, hoa to và rực rỡ. Với ngoại hình bắt mắt, bày cây phát tài có thể gia tăng cảnh quan, sinh động không gian, mang tới vẻ đẹp cho ngôi nhà.

Cây phát tài, nghe tên đã thấy vui mừng, nên đặt ở trước cửa nhà, mặt tiền cửa hàng rất thích hợp. Đặt ở phòng khách thì tăng vẻ trang nhã và phong thái tự nhiên, gần gũi cho ngôi nhà.

Cây phát tài hợp với mệnh gì để đem lại tài Lộc cho gia chủ

Thiết mộc lan, Thiết mộc lan ghép (sọc vàng) thuộc hành Thổ nên hợp với những người mang mệnh Kim

Các loại Cây phát tài hiện nay đang làm cây cảnh

  • cây phát tài núi
  • cây phát tài búp sen
  • cây phát tài nhật
  • cây phát tài đỏ
  • cây phát tài đài loan
  • cây phát tài khúc
  • cây phát tài để bàn
  • cây phát tài mini
  • cây phát tài nam mỹ
  • cây phát tài singapore
  • cây phát tài thủy canh

Cây phát tài nên đặt ở đâu thì mang lại tiền tài cho gia chủ ?

Trong cuộc sống, Tài – lộc và Công danh ngoài năng lực bản thân còn một phần nhờ đến sự may mắn. Và hầu như, ai cũng muốn may mắn đó đến với mình. Chính vì vậy, cây Phát tài sẽ là lựa chọn hàng đầu trong việc bố trí cây nội thất bởi ngay từ tên gọi cũng đã thấy cây sẽ mang lại sự phú quý, giàu sang và may mắn cho gia chủ. Bên cạnh việc lựa chọn cây có dáng vóc đẹp thì việc tìm hiểu và lựa chọn vị trí thích hợp sẽ càng làm tăng giá trị và ý nghĩa của cây.

Trồng cây phát lộc (phát tài) có thể trồng trong nhà, ngoài vườn, trong phòng làm việc, bàn làm việc, phòng họp, phòng ăn… Bạn nên trồng phát lộc ở phía Đông hoặc Đông Nam ngôi nhà – khu vực đại diện cho Mộc và là nơi có ánh sáng thích hợp cho cây. Phát lộc tượng trưng cho ngũ hành vì vậy nó rất may mắn, ngũ hành của phất dụ như sau: Số lượng cây khác nhau mang lại tác dụng phong thủy khác nhau, cụ thể như sau:

Cách Trồng và chăm sóc Cây phát tài

Chế độ Nước: Có chế độ tưới nước phù hợp. Đối với cây nội thất trong chậu lớn. hoặc có thể tưới nước 3 ngày/lần cho cây, tránh tưới nước nhiều.

Đất trồng: Trồng ở nơi đất tơi xốp nhiều dưỡng chất.

Ánh sáng: Để lá có màu sắc đẹp và thân khỏe mạnh nên đặt cây nơi có nhiều ánh sáng tự nhiên.

Mua Cây phát tài ở Đâu Thành Phố Hồ Chí Minh

Nếu quý khách có nhu cầu mua Cây phát tài về trồng trang trí nội thất hoặc trang trí văn phòng có thể qua vườn cây của công ty chúng tôi tại 46/11 Âu Dương Lân, Phường 3, Quận 8, Hồ Chí Minh, hoặc liên hệ theo số điện thoại sau để nhân viên công ty tư vấn và giao hàng cho quý khách

hoặc qua zalo


【#2】Hoàn Thiện Quy Trình Nhân Giống Lan Kim Tuyến (Anoectochilus Setaceus Blume) Bằng Kỹ Thuật Nuôi Cấy Mô Tế Bào

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH – KTNN

===o0o===

PHẠM THỊ NHUNG

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH

NHÂN GIỐNG LAN KIM TUYẾN

(ANOECTOCHILUS SETACEUS BLUME)

BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ

BÀO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

HÀ NỘI, 2021

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH – KTNN

===o0o===

PHẠM THỊ NHUNG

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH

NHÂN GIỐNG LAN KIM TUYẾN

(ANOECTOCHILUS SETACEUS BLUME)

BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ

BÀO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

Người hướng dẫn khoa học:

TS. La Việt Hồng

HÀ NỘI, 2021

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến

TS. La Việt Hồng đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp

đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Tôi xin chân thành cảm ơn ban Lãnh đạo trường Đại học Sư phạm Hà

Nội 2, Ban chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN trường học Sư phạm Hà Nội 2, đã

tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành khóa luận này.

Trong thời gian thực hiện đề tài tôi cũng nhận được sự giúp đỡ tận

tình của cô Mai Thị Hồng – Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật đã giúp đỡ,

đóng góp ý kiến để tôi hoàn thành khóa luận này, nhân đây tôi cũng xin

chân thành cảm ơn.

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, tạo mọi

điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi học tập cũng như hoàn thành

khóa luận.

Mặc dù đã hết sức cố gắng nhưng do điều kiện thời gian và trình độ

chuyên môn còn nhiều hạn chế nên không tránh khỏi những thiếu sót, tôi

rất mong nhận được sự góp ý của quý thầy cô để khóa luận của tôi có thể

hoàn thiện hơn.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 12 tháng 04 năm 2021

Sinh viên

Phạm Thị Nhung

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan kết quả nghiên cứu đề tài: “Hoàn thiện quy trình

nhân giống lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) bằng kỹ

thuật nuôi cấy mô tế bào” là kết quả nghiên cứu của riêng tôi do TS. La Việt

Hồng hướng dẫn. Các số liệu, kết quả trong nghiên cứu này là trung thực và

chưa được ai công bố.

Hà Nội, ngày 12 tháng 04 năm 2021

Sinh viên

Phạm Thị Nhung

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

NAA:

Napthlacetic acid

BAP:

6-Benzyl amino purin

KI:

Kinetin

MS:

Murashige và Skoog

Nxb:

Nhà xuất bản

CT:

Công thức

ĐC:

Đối chứng

TDZ:

Thidiazuron

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ………………………………………………………………………………………….. 1

1. Lý do chọn đề tài …………………………………………………………………………. 1

2. Mục đích nghiên cứu ……………………………………………………………………. 3

3. Nội dung nghiên cứu ……………………………………………………………………. 3

4. Phạm vi nghiên cứu ……………………………………………………………………… 3

5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn ……………………………………………. 3

NỘI DUNG ……………………………………………………………………………………….. 4

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ……………………………………………………. 4

1.1. Giới thiệu về cây lan Kim tuyến………………………………………………….. 4

1.1.1. Phân loại ……………………………………………………………………………. 4

1.1.2. Đặc điểm thực vật học ………………………………………………………….. 4

1.1.3. Sinh học và sinh thái ……………………………………………………………. 5

1.1.4. Phân bố ………………………………………………………………………………. 5

1.1.5. Công dụng của lan Kim tuyến ……………………………………………….. 5

1.1.6. Thực trạng khai thác và phát triển cây lan Kim tuyến

ở Việt Nam …………………………………………………………………………………… 8

1.1.7. Các loài lan Kim tuyến có ở Việt Nam ……………………………………. 8

1.2. Tình hình nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn lan Kim tuyến …….. 10

1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ……………………………………….. 10

1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ………………………………………….. 12

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……………….. 15

2.1. Vật liệu thực vật ……………………………………………………………………… 15

2.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ………………………………………………….. 15

2.2.1. Dụng cụ ……………………………………………………………………………. 15

2.2.2. Thiết bị ……………………………………………………………………………… 15

2.3. Môi trường nuôi cấy ………………………………………………………………… 15

2.4. Điều kiện nuôi cấy in vitro ……………………………………………………….. 15

2.5. Phương pháp nghiên cứu ………………………………………………………….. 16

2.5.1. Bố trí thí nghiệm ………………………………………………………………… 16

2.5.3. Phương pháp phân tích thống kê kết quả thực nghiệm ……………. 18

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN …………………….. 19

3.1. Hoàn thiện giai đoạn tái sinh lan Kim tuyến in vitro ……………………. 19

3.2. Hoàn thiện giai đoạn ra rễ tạo cây lan Kim tuyến in vitro

hoàn chỉnh…………………………………………………………………………………….. 22

3.3. Hoàn thiện giai đoạn rèn luyện cây lan Kim tuyến với điều kiện

tự nhiên ………………………………………………………………………………………… 24

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ……………………………………………………………. 26

TÀI LIỆU THAM KHẢO ……………………………………………………………….. 27

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Ảnh hưởng của BAP và Kinetin đến khả năng tạo cụm chồi

cây lan Kim tuyến ………………………………………………………………17

Bảng 2.2: Ảnh hưởng của α – NAA đến tạo rễ của cây lan Kim tuyến

in vitro………………………………………………………………………………17

Bảng 2.3: Ảnh hưởng của giá thể tới tỉ lệ sống của lan Kim tuyến

in vitro………………………………………………………………………………18

Bảng 3.1. Kết quả tái sinh chồi lan Kim tuyến (số chồi/mẫu) ………………..19

Bảng 3.2. Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh in vitro lan Kim tuyến

Bảng 3.3. Rèn luyện cây in vitro ngoài tự nhiên

………………..23

………………………………24

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume ………………………. 4

Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu ………………………………………………………………… 16

Hình 3.1. Cụm chồi lan Kim tuyến ……………………………………………………… 21

Hình 3.2. Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh in vitro từ chồi lan Kim tuyến…………… 23

Hình 3.3. Rèn luyện cây lan Kim tuyến ngoài môi trường tự nhiên ở các

giá thể khác nhau ………………………………………………………………… 25

MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài

Lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) thuộc họ Phong lan

(Orchidaceae) là loại thảo dược quý hiếm của Việt Nam và nhóm thực vật rừng đang nguy cấp EN A1a, c, d, trong

sách đỏ Việt Nam .

Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng khắc phục được nhiều trở

ngại mà những phương pháp nhân giống khác thường gặp, sau đây là những

ưu điểm chính: cây con được trẻ hóa và sạch bệnh, vì vậy có tiềm năng sinh

trưởng, phát triển và đạt năng suất cao. Tạo cây con đồng nhất về mặt di

truyền, bảo tồn được các tính trạng đã chọn lọc. Tạo được dòng thuần của

các cây tạp giao. Tạo được cây có gen mới (đa bội, đơn bội). Bảo quản và

lưu trữ tập đoàn gen. Có khả năng sản xuất quanh năm. Có thể nhân nhanh

nhiều cây không kết hạt trong những điều kiện sinh thái nhất định hoặc hạt

nảy mầm kém. Hệ số nhân giống cực cao, rút ngắn thời gian đưa một giống

mới vào sản xuất đại trà .

Quá trình nhân giống cây trồng trong môi trường in vitro gồm nhiều

giai đoạn khác nhau gồm: (i) tạo vật liệu khởi đầu; (ii) nhân nhanh chồi; (iii)

ra rễ cho chồi in vitro và (iv) chuyển cây ra rèn luyện với điều kiện tự nhiên.

Mỗi giai đoạn có những yêu cầu riêng. Trong đó giai đoạn quan trọng nhất

quyết định sự thành công của quy trình nuôi cấy là giai đoạn nhân nhanh

chồi và giai đoạn rèn luyện cây con thích nghi với môi trường tự nhiên . Năm 2014, tác giả Trần Thị Hồng Thúy và cộng sự đã tìm ra

môi trường Knudson C lỏng chứa 1% saccarozơ, 100 ml.L-1 nước dừa và

0,5 mg.L-1 Kinetin, tỉ lệ hình thành PLBs đạt 86,25%, PLBs sinh trưởng tốt

… Tuy nhiên, việc

nghiên cứu này mới chỉ dừng lại ở một số giai đoạn mà chưa hoàn thiện

được quy trình nhân giống cây lan này. Do vậy, tôi quyết định nghiên cứu

đề tài: “Hoàn thiện quy trình nhân giống lan Kim tuyến (Anoectochilus

setaceus Blume) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào” nhằm cải thiện một

số giai đoạn của quy trình nhân giống in vitro loài lan này với mục đích bảo

tồn và phát triển được nguồn giống lan Kim tuyến, cung cấp cây giống có

chất lượng cho thị trường.

Phạm Thị Nhung

2

2. Mục đích nghiên cứu

Hoàn thiện quy trình nhân nhanh loài lan Kim tuyến (Anoectochilus

setaceus Blume) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào, nhằm góp phần bảo

tồn và phát triển loài lan dược liệu quý hiếm của Việt Nam, đáp ứng nhu cầu

cây lan Kim tuyến giống phục vụ nhu cầu con người.

3. Nội dung nghiên cứu

Hoàn thiện giai đoạn nhân nhanh giống cây lan Kim tuyến bằng kỹ

thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật.

Hoàn thiện giai đoạn ra rễ của lan Kim tuyến in vitro.

Hoàn thiện giai đoạn rèn luyện cây con lan Kim tuyến in vitro.

4. Phạm vi nghiên cứu

Phòng thí nghiệm Sinh lí thực vật, khoa Sinh – KTNN, trường Đại học

Sư phạm Hà Nội 2.

5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

5.1. Ý nghĩa khoa học

Góp phần bổ sung vào nguồn tài liệu nghiên cứu về nhân giống in vitro

cây lan Kim tuyến.

5.2. Ý nghĩa thực tiễn

Tạo ra được nguồn cây giống với số lượng lớn và sạch bệnh cung cấp

cho thị trường.

Góp phần bảo tồn được nguồn gen của loài lan Kim tuyến.

Phạm Thị Nhung

3

NỘI DUNG

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu về cây lan Kim tuyến

1.1.1. Phân loại

Giới: Plantea (Thực vật)

Bộ: Asparagales

Họ: Orchidaceae

Phân họ: Orchidoideae

Chi: Anoectochilus

Loài: A. setaceus

Tên khoa học: Anoectochilus

setaceus Blume

Tên Việt Nam: Lan Kim tuyến

Hình 1.1. Lan Kim tuyến

Anoectochilus setaceus Blume

Tên gọi khác: Lan Gấm

.

Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, chóp hơi nhọn và có mũi ngắn, cỡ 3 – 4

x 2 – 3 cm, có màu khác nhau với mạng gân thường nhạt hơn (màu lục sẫm

Phạm Thị Nhung

4

với mạng gân màu lục nhạt hay màu nâu – đỏ với mạng gân màu vàng – lục

hay hồng); cuống lá dài 2 – 3 cm .

1.1.3. Sinh học và sinh thái

Mùa hoa tháng 2 – 4. Tái sinh bằng chồi từ thân rễ và hạt, ít và sinh

trưởng rất chậm. Mọc dưới tán rừng nguyên sinh, hầu hết là nguyên thủy,

rậm thường xanh nhiệt đới mưa mùa cây lá rộng trên sườn núi đá granit,

riôlit, phiến sét, ở độ cao 500 – 1600 m, rải rác thành từng nhóm vài ba cây

trên đất ẩm, rất giàu mùn và lá cây rụng .

Thế giới: Ấn Độ, Nêpan, Butan, Trung Quốc, Mianma, Thái Lan, Lào,

Campuchia, Malaixia, Inđônêxia .

Ông Tả Mộc Thuấn – học giả người Nhật (năm 1924), nghiên cứu về

Trung y đã cho biết: Kim tuyến liên là một trong những cây thuốc quý trong

dân gian; toàn thân cây thuốc được dùng để làm tăng cường sức khỏe, chủ

trị bệnh phổi, di tinh, xuất tinh sớm, yếu gan, yếu tỳ và các vết thương do

rắn cắn; còn có tác dụng bổ máu, giải nhiệt .

Trong sách Thanh thảo gia đình tự liệu pháp của ông Trần Đào Thích

có viết: Trẻ em hay khóc dùng Kim tuyến liên sắc uống sẽ khỏi .

Trong báo cáo điều tra năm 1964, ông Cam Vĩ Tùng đã cho biết: Kim

tuyến liên là một vị thuốc hết sức quý giá trong các tiệm thuốc bắc Đài

Loan, là cây thuốc mang tính mát và có vị ngọt, thanh nhiệt, thanh huyết, bổ

phổi, giải trừ u uất, thông trung khí, bồi dưỡng sức khỏe, chủ trị lục phủ ngũ

tạng đẩy lùi tâm hỏa, nóng gan, bệnh phổi, thổ huyết, ho hen, đau ngực, đau

lá lách, đau cuống họng, cao huyết áp, trẻ con chậm lớn, suy thận .

Phạm Thị Nhung

6

Trong y học hiện đại bằng nhiều công trình nghiên cứu khoa học, các

nhà khoa học ở nhiều Viện và Trường đại học Y trên thế giới đã cung cấp

các bằng chứng cho thấy nhiều công dụng của lan Gấm – lan Kim tuyến như

.

Đặc biệt, cách đây vài năm, rộ lên cơn sốt lan Gấm khi các đầu mối

Hàn Quốc, Đài Loan, Trung Quốc mua lại với giá khoảng 3,5 – 4 triệu đồng

/1 kg tươi. Vì vậy, rất nhiều người dân đã lặn lội trong rừng sâu, lùng hái lá

lan Gấm để bán cho các đầu mối thu mua với giá khoảng 500 ngàn đồng

1/kg lá tươi, dần dần khi khan hiếm, cạn kiệt, giá của lan Gấm được đẩy lên

1,2 – 1,6 triệu đồng/1 kg lá tươi .

Phải chăng, đã đến lúc chúng ta phải có những đánh giá nghiêm túc,

công trình nghiên cứu chính thức về giá trị tài nguyên của dược liệu quý,

chẳng hạn như cây lan Gấm… Để từ đó, có được những hướng phát triển

cũng như khai thác các loại dược liệu quý, thay vì để các doanh nghiệp nước

ngoài lợi dụng sự thiếu hiểu biết của ta để trục lợi.

1.1.7. Các loài lan Kim tuyến có ở Việt Nam

Theo GS. Phạm Hoàng Hộ (Cây cỏ Việt Nam, tập III), ở Việt Nam chi

lan Kim tuyến gồm có những loài sau .

Với công trình nghiên cứu gieo hạt in vitro cây A. roxburghii, tác giả

Huang H và cộng sự (2002) đã tìm ra được môi trường Knudson C có bổ

sung 0,5 mg/L BAP + 20% dịch khoai tây là thích hợp nhất cho sự phát triển

protocom từ hạt của A. roxburghii .

Y.J. Shiau và cộng sự (2005) nghiên cứu nhân giống loài lan Kim

tuyến (Haemaria discolor (Ker) Lindl. var.) bằng phương pháp gieo hạt in

vitro. Các hạt sau khi nảy mầm cấy chuyển trên môi trường ½ MS bổ sung

0,2% than hoạt tính, 8% dịch chuối, 0,1 mg dm-3 (TDZ) và 1,0 mg dm-3

(NAA) cho cây sinh trưởng và phát triển tốt. Có tới 96% cây sống sau khi

chuyển ra nhà kính .

Nghiên cứu kĩ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng nhằm mục tiêu bảo tồn

và phát triển cây A. elatus Lindley, tác giả N. Ahamed Sherif và cộng sự

(2012) đã sử dụng chồi đỉnh và chồi bên làm vật liệu nuôi cấy. Trên môi

Phạm Thị Nhung

11


【#3】Lan Kim Tuyến Ngâm Rượu Có Tác Dụng Gì? Mua Lan Kim Tuyến Ở Đâu

Lan kim tuyến là một loài cây không chỉ quen thuộc với những người chơi lan rừng mà còn là vị thuốc được dùng phổ biến, rộng rãi trong y học. Vị thuốc này có tác dụng chữa suy nhược thần kinh, ăn uống kém, ho, khạc ra máu, lao phổi, phong tê thấp, chấn thương, đau nhức xương khớp, viêm phế quản, viêm gan, kháng khuẩn, tăng cường sức khỏe, …

Loài cây này còn có rất nhiều tên gọi khác. Lan kim tuyến hay còn gọi là lan kim tuyến rừng, kim tuyến liên, lan gấm, lan kim tuyên đỏ, lan kim tuyến xanh, mộc sơn thạch sùng, … Loài cây này cò tên khoa học là Anoechilus roxburglihayata

Mô tả đặc điểm của cây

Lan kim tuyến có mấy loại? Lan kim tuyến có đến 40 loại khác nhau, mỗi loại có một giá trị khác nhau. Trong đó có một giống cây có giá trị cao trong y học. Bạn có thể nhận dạng vị thuốc này thông qua các đặc điểm sau.

Lan kim tuyến là gì? Đây là cây họ nhà lan, sống dưới các tán cây lớn, ưa bóng râm. Thân cao tầm 10 đến 20 cm, cây thân mềm, mọng nước có màu tím, tím nhạt, tiến dần vê ngọc cây thân có phủ một lớp lông mao. Lá cây nhỏ, hình bầu thuôn dài về phía hai đầu mọc đối kích thước chiều dài 3-4 cm, rộng 2-3 cm. Lá cây một mặt xanh, một mặt màu tía hoặc đỏ tía pha lẫn màu trắng. Cuống lá dài 2 đến 3 cm, gốc cuống tiếp xúc với thân hình bẹ ôm lấy thân cây. Hoa mọc thành từng chùm, dạng dài, bao phủ lớp lông thưa. Cây vào tháng 10 đến tháng 12 và kết quả vào tháng 12 đến tháng 3 năm sau. Cây này có thể sinh sản vô tính bằng chồi non.

Khu vực phân bố

Lan kim tuyến mọc ở đâu? Lan kim tuyến mọc ở các hu rừng rậm, mọc dưới các tán cây lớn. Loài cây này ưa khí hậu ẩm, đất tơi xốp, ưa bóng râm. Vì vậy mà lan kim tuyến thường xuất hiện ở các khu rừng lớn khu vực các tỉnh phía tây bắc Việt Nam như Yên Bái, Cao Bằng, Lào Cai, Lai Châu, Tuyên Quang, Hòa Bình.

Thành phần hóa học

Y học hiện đại đã phân tích và xác định được Anoectochilus chứa các thành phần hoạt chất có dược tính cực kì quan trọng bao gồm: Flavonoid (quercetin, isorhamnetin), steroid (24 ~ isopropenyl cholesterol, sterol, ergosrol, stigmasterol, campesterol, sitosterol β-), trierpenoids (friedelin, axít succinic, axít coumaric, axít ferulic, daocosterol, axít palmitic, axit aleanolic, axít bearberry) và đường (Polysaccharides 13,32%, Oligosacharides 11,24%, đường đơn 9,73%), alkaloid, glycoside tim mạch, este, taurine, axít amin, nguyên tố vi lượng và các loại khoáng chất khác …

– Thành phần Polysaccharide, taurine, axít amin, đường tốt và các khoáng đa vi lượng có trong Anoectochilus còn cao hơn cả loài nhân sâm mọc hoang dã nên còn được xưng tụng là Nam Trùng Thảo.

– Các Phytochemical gồm flavonoid glycosides kisenone từ Anoectochilus chống gốc tự do mạnh gấp 5 lần hợp chất Catechin (chất chống ôxy hóa EGCG nổi tiếng của trà xanh).

– Các hoạt chất sinh học của Anoectochilus cũng bảo vệ phân cắt sợi DNA bởi siêu gốc tự do hydroxyl OH- gây đột biến tế bào (nguyên nhân chính gây bệnh tật, đặc biệt là ung thư) mạnh gấp 6 lần so với nhân sâm.

Tính vị

Theo Đông y lan kim tuyến có vị ngọt, tính mát tác dụng thanh nhiệt giải độc, bổ tỳ can, thận.

Bộ phận sử dụng

Toàn bộ thân cây được sử dụng làm thuốc chữa bệnh

Thu hái và chế biến

Lan kim tuyến rất hiếm và khó tìm thấy, cần phải trong rừng sâu mới tìm được, sau khi thu hái về, người dân đem rửa sạch, để ráo nước rồi thái nhỏ phơi hoặc sấy nhẹ cho khô. Đựng trong túi bóng kín, để nơi khô ráo thoáng mát tránh ánh nắng trực tiếp từ mặt trời.

Công dụng

Lan kim tuyến chữa bệnh gì? Lan kim tuyến không chỉ là loài cây cảnh quen thuộc với những người chơi lan rừng nó còn là một những vị thuốc quý thường xuyên được sử dụng trong y học. chúng có công dụng rất tốt trong việc hỗ trợ và điều trị rất nhiều bệnh như:

– Viêm gan

– Đau bụng

– Vết thương bị rắn cắn

– Sốt cao

– Các chỗ bị sưng do va đập

– Giúp bổ máu, tăng cường sức khỏe

– Chữa suy nhược thần kinh

– Trị chứng xuất tinh sớm, di tinh

– Trị viêm phế quản, ho khan, đau họng, tiêu đờm

– Bổ gan, thận, phổi

– Giải độc, thanh nhiệt

– Phong tê thấp, đau nhức xương khớp

– …

Các đối tượng sử dụng

– Người bệnh bị đau bụng

– Người bị rắn cắn

– Người bị đau nhức xương khớp, phong tê thấp

– Người bị viêm họng, viêm phế quản, ho có đờm

– Nam giới bị di tinh, xuất tinh sớm

– Người già, trẻ nhỏ muốn bồi bổ sức khỏe

– Người bị nóng trong, độc cơ thể

Các bài thuốc từ lan kim tuyến

Bài thuốc 1: chữa suy nhược thần kinh, mất ngủ

Các vị thuốc lấy lan gấm 25gr, 8 gr tâm sen, 12 gr hoài sơn, 20 gr quyết minh tử, 12 gr hoa nhài, hoa thiên lý 10gr, 8 gr ngưu tất, mạch môn 15gr, huyền sâm 10gr, 8 gr cam thảo đất. Tất cả các vị thuốc đem rửa sạch sắc nước uống hàng ngày, mỗi ngày một thang, chia uống 3 lần trong ngày uống khoảng 3 đến 5 thang.

Bài thuốc 2: chữa ăn uống kém

Các vị thuốc cây lan kim tuyến lấy 25 gr, quyết minh tử 5 gr, 20 gr huyền sâm, 5 gr trần bì, liên nhục 8 gr, 6 gr sơn tra, 10 gr hoài sơn, sắc nước uống hàng ngày, chia uống 3 lần trong ngày mỗi ngày sắc uống 1 thang. Một liệu trình 7 thang

Bài thuốc 3: chữa ho khạc ra máu tươi

Các vị thuốc lan gấm lấy 30gr, ngưu tất, quyết minh tử mỗi vị lấy 15gr, hoài sơn, huyền sâm mỗi vị lấy 20 gr, 25 gr mạch môn, tất cả đem sắc nước uống hàng, mỗi ngày một thang chia đều 3 lần. Một liệu trình dùng 5 đến 7 thang.

Ngoài ra còn nhiều cách sử dụng lan kim tuyến, người dân còn dùng lan kim tuyến sắc nước hàng ngày hoặc ngâm lan kim tuyến với rượu. Lan kim tuyến ngâm rượu có hai cách ngâm, ngâm dạng khô và ngâm dạng tươi.

Bài thuốc 4: chữa vết thương bị sưng do va chạm

Dùng 20gr lan kim tuyến tươi hoặc 5gr khô giã nát đắp lên vết thương sau đó băng lại.

Cách ngâm lan kim tuyến với rượu

    Ngâm lan kim tuyến tươi với rượu

Nguyên liệu: 1 kg lan kim tuyến tươi, 10 -12 lít rượu ngon, nồng độ 40 – 45 độ, bình đựng rượu.

Cách ngâm: lan kim tuyến tươi đem rửa sạch để ráo nước rồi thái nhỏ thành các đoạn ngắn vừa kích thước bình sau đó đặt vào bình rồi đổ rượu vào ngâm vị thuốc. đậy kín, bảo quản nơi khô ráo, thoáng mát, sau một 1 tháng có thể sử dụng được.

    Ngâm lan kim tuyến khô với rượu

Nguyên liệu: lá lan kim tuyến khô 1 lạng, rượu ngon, 40 -45 độ 8 -10 lít, bình đựng rượu.

Cách ngâm: lá lan kim tuyến đem sao với lửa khoảng 3 – 4 phút sau đó đổ vào bình ngâm với rượu, đậy kín nắp sau 1 tháng là có thể sử dụng được.

Rượu lan kim tuyến bảo quản nơi khô ráo thoáng mát ở nhiệt độ 25 độ C tránh nắng trực tiếp từ mặt trời.

Lan kim tuyến ngâm rượu có tác dụng tăng cường sức khỏe, sinh lực, điều hòa khí huyết, cải thiện giấc ngủ, chữa chứng sinh lí yếu ở nam giới.

Liều dùng: không sử dụng quá 50 ml mỗi ngày sẽ làm phản tác dụng, chia ra làm 2 lần uống trong ngày.

Lưu ý khi sử dụng lan kim tuyến

– Tuyệt đối tuân thủ liều lượng trong quá trình sử dụng

– Khi sử dụng cho phụ nữ mang thai, trẻ nhỏ nên tham khảo kĩ ý kiến của thầy thuốc.

– Sử dụng vị thuốc khô nên chú ý tránh sử dụng sản phẩm đã bị mốc, biến chất.

Địa chỉ mua vị thuốc lan kim tuyến chất lượng

Hiện nay có rất nhiều cơ sở bán lan gấm nhưng trước thực trạng vị thuốc nam giả được bày bán tràn lan thì bạn cần thực sự chú ý. Bạn nên tìm hiểu kĩ về chất lượng, cũng như giá thành sản phẩm, nên tìm đến những địa chỉ quen thuộc, uy tín, đảm bảo chất lượng.

Lan kim tuyến giá bao nhiêu? Giá lan kim tuyến còn phụ thuộc vào thời vụ nếu của lan kim tuyến được thu hái vào đúng mùa thì giá thành tương đối ổn định và rẻ hơn so với khi mua ngoài mùa vụ.

Lan kim tuyến mua ở đâu? Lan kim tuyến bán ở đâu?


【#4】Chiêm Ngưỡng Top 10 Loại Hoa Lan Đẹp Nhất Việt Nam 2021

Các loại hoa phong lan đẹp mang trong mình một điều bí ẩn, sức hút hấp dẫn làm mê mẫn người chơi. Bởi mang trong mình hình ảnh đẹp và độc đáo nên hoa lan được xem như nữ hoàng các loài hoa.

Hoa lan là một trong những sản vật của tạo hóa, là tác phẩm nghệ thuật tuyệt tác mà thiên nhiên ban tặng cho con người. Hoa phong lan có vẻ đẹp, sức hấp dẫn người chơi đến kỳ lạ. Có thể nói hoa lan hội tụ tất cả các đặc điểm quý của các loài hoa đẹp như màu sắc đẹp, phong phú, cấu tạo hoa đa dạng, tinh tế, hoa có độ bền lâu và đặc biệt hấp dẫn người chơi bởi hương thơm quyến rũ.

Chiêm ngưỡng vẻ đẹp của hoa phong lan, tâm hồn con người như được giao hòa cùng thiên nhiên. Các bậc cao niên thời xưa cho rằng: hoa phong lan mang tất cả các tính cách thanh cao của người quân tử, đó là: nhân, lễ, nghĩa, trí, tín.

Tại sao hoa lan lại hội tụ tất cả các đặc điểm quý của các loài hoa khác và được coi như nữ hoàng của các loài hoa?

Câu trả lời nằm ở cấu tạo đặc biệt của hoa phong lan. Hoa lan có 3 cánh đài, 3 cánh tràng, 1 trong 3 cánh tràng biến dạng thành hình lưỡi có 3 thùy gọi là cánh môi, 3 cánh đài giống với 2 cánh tràng còn lại tạo thành bông hoa có 5 cánh và một cánh môi. Nhờ đặc điểm cánh hoa ấn tượng đã tạo nên một loài hoa lan đẹp, quyến rũ.

Đầu trục hoa là nhị đực chứa 2 hạt phấn được bao phủ bởi nắp bao phấn rất chặt chẽ. Dưới nhị đực là nhụy có hình lõm và có nhiều chất nhày khi hoa nở để sẵn sàng kết dính và tiếp nhận hạt phấn.

Do đặc điểm của hầu hết các loài lan là khả năng tự thụ phấn kém (nguyên nhân là do nắp bao phấn đóng rất chắc và hạt phấn không tiếp cận được với nhụy hoa) nên không thể xảy ra quá trình thụ phấn mà phải nhờ đến các loài côn trùng lớn như ong, bướm…đến thụ phấn cho hoa. Chính bởi sự giao phấn ngẫu nhiên này đã tạo cho hoa phong lan nhiều đặc tính quý giá: hoa có nhiều hình dáng đẹp, cấu tạo hoa phong phú, màu sắc hấp dẫn và hương thơm ngọt ngào quyến rũ.

Có tên khoa học là Dendrobium Lituiflorum, thân cây khá lớn so với các loại lan đẹp khác, thường rủ xuống khi cây dần trưởng thành. Độ dài trung bình của thân cây rơi vào 50-80 cm.

Loài lan rừng quý hiếm này nở hoa vào cuối mùa đông hàng năm, nở theo chùm khá lớn, rất thơm và lâu tàn. Kích thước của mỗi bông khoảng 6-7 cm, một chùm nhỏ có 2-3 bông.

Là một trong các loại lan rừng đẹp dễ trồng hiện nay nhưng còn tùy vào thời tiết mỗi nơi. Có thông tin cho rằng mỗi cây hoa Thảo Kèn có giá từ 2 – 3 triệu đồng. Chính vì sự đắt đỏ và quý hiếm của loài hoa phong lan rừng này mà người ta đã có ý định nuôi cấy đại trà để giảm thiểu mật độ săn lùng.

Việc chơi lan và trồng lan là cả một nghệ thuật đòi hỏi sự khó khăn cũng như tự hào. Chính vì thế mà không có công thức chung nào cố định cả. Lan giả hạc là một loại lan đẹp độc đáo với cách trồng không quá khó.

giúp nhà vườn nâng hạ và di chuyển nhanh chóng các chậu hoa, chậu cảnh.

Thuộc danh sách các loại lan rừng quý hiếm năm 2021 ở Việt Nam, lan Trầm vàng có vẻ đẹp rực rỡ và quyến rũ người xem. Loại hoa lan rừng đẹp này có mùi thơm khá nồng nàn chứ không thoang thoảng như các loài hoa khác.

Lan Trầm vàng thường trồng trong chậu nhỏ chứ không gán vào thân gỗ. Khi trưởng thành cây có kích thước khá nhỏ, lá to, dẹt và dài. Hoa nở vào tháng 3 – 5 hàng năm. Bông hoa có độ lớn trung bình, màu vàng rực, hơi bóng nhẹ ở phía trong cánh hoa và có màu nâu nổi bật ở nhụy hoa.

Các loại hoa lan đẹp và quý như Trầm vàng cần sự chăm sóc đặc biệt. Không nên tưới nước quá nhiều vì đất trồng lan là đất ẩm, chỉ nên tưới 1 tuần 2 lần dưới dạng phun sương. Tuy chăm sóc khó khăn nhưng khi nhìn thấy bông hoa đầu tiên nở bạn sẽ hiểu tại sao lại có những người yêu hoa đến vậy.

– Tại nơi trồng, nên đảm bảo nhiệt độ, ánh sáng phù hợp. Tốt nhất tránh để chậu lan tiếp xúc trực tiếp dưới ánh nắng mặt trời khiến cây cháy lá và chậm lớn. Nên đặt chậu ở nơi có độ ẩm 70 – 90 % và nhiệt độ 18-25 độ để cây phát triển tốt. Đến khi lan trầm ra hoa, nhiệt độ cần giữ ở mức 13-15 độ và duy trì trong khoảng 4-6 tuần.

– Về phân bón, bạn nên bón mỗi tuần một lần hàm lượng phân bón NPK theo tỉ lệ 30-10-10 hay 20-20-20 đầy đủ cho cây. Nếu cây có dấu hiệu úa vàng, chuẩn bị rụng lá thì chuyển sang tỉ lệ 10-30-20 để kích thích cây ra nụ.

Bởi lan trầm vàng không chỉ đẹp mà còn có hương thơm nhẹ nhàng, dễ chịu; còn gì thích bằng khi mỗi sớm mai thức dậy, bạn lại được nhìn thấy những chậu lan trầm vàng do chính tay mình trồng và chăm sóc mỗi ngày trổ ra những bông hoa rực rỡ.

Hoa lan Nghinh Xuân còn có tên gọi khác là hoa lan Lai Châu hay Ngọc Điểm, là một trong những các hoa đẹp nhất, được ưa chuộng ở Việt Nam. Thông thường, trước tết khoảng 2 tháng nghinh xuân bắt đầu đâm nụ hoa.

Là một loại hoa phong lan rễ gió trồng không cần giá thể chỉ cần có nơi để cây bám là được. Đa phần có màu trắng và tím, tuy nhiên hàng ngoại nhập có thể có màu tím, vàng tạo nên một loại hoa lan đẹp, đậm nét đặc trưng… Nghinh xuân là loại hoa lan có mùi rất thơm dễ chịu đặc biệt thích hợp chưng những ngày Tết.

Tháng 11 âm lịch: Chồi non của lan Ngọc Điểm 1 – 2 cm

– Giai đoạn này cần theo dõi sự phát triển của chồi hoa. Đồng thời, theo dõi bệnh, nấm, nhện, kiến….

– Thông thường Ngọc điểm nở hoa vào cuối mùa đông hay đầu mùa xuân và vào dịp Tết Nguyên Đán. Khi thấy lan ra nụ, hãy phun nước hoặc tăng thêm độ ẩm hoặc tưới sơ qua. Muốn lan nở sớm hơn hãy tăng thêm nhiệt độ hay là mang vào trong nhà để dưới ánh đèn, nhưng cần thoáng gió và độ ẩm.

Nếu muốn lan chậm nở hãy mang vào chỗ rợp mát, vào phòng lạnh hoặc để nước đá ở gần, nhưng đừng cho vào gốc hay để rễ chạm vào.Tăng giảm nhiệt độ khá khó khăn với những người chơi lan tài tử, nhưng đối với nhà vườn có đủ hệ thống điều hòa nhiệt độ thì việc này chẳng có gì khó.

Đây là một trong các loại lan rừng đẹp nhất Việt Nam được nhiều dân chơi lan săn đón. Có 4 loại lan Tuyết Nhung, người ta chia tên các loại hoa lan ở Việt Nam này dựa theo hình thái và màu sắc của nó: Tuyết Nhung Giún (Dạ Vỹ), Tuyết Nhung Vàng (Hoàng Nhung), Tuyết Nhung Trơn (Phượng Vỹ) và Tuyết Nhung Việt – được tìm thấy tại Hà Giang.

Đa phần lan Tuyết Nhung có màu đỏ, chỉ riêng Tuyết Nhung Vàng là có màu sắc khác. Tùy theo mỗi loại mà chiều dài thân cây có thể lên đến 2 – 5 m. Cánh hoa nhỏ, dài, nở tung khắp phía. Người chơi lan thường trồng loại cây này ở nơi có bóng râm, thoáng mát và luôn để ý độ ẩm.

– Chế độ ánh sáng: Đưa cây lan phượng vĩ ra ngoài để cây chịu hoàn toàn ánh sáng tự nhiên.

– Chế độ tưới nước: Cắt nước hoàn toàn trong mùa đông.

– Chế độ phân bón: Không bón phân trong mùa đông.

– Môi trường yêu cầu: Môi trường phải hanh, khô, nhiều gió, ánh sáng là 100% ánh sáng tự nhiên.

Thuộc các loại lan đẹp nổi bật có bông rất dày cánh và rất lâu tàn, hoa cẩm báo có nền màu vàng và các đốm màu nâu nhìn như da báo nên có tên hoa lan là cẩm báo. Nó có bộ rễ rất gió khoẻ, vươn ra ngoài hút độ ẩm trong không khí để sống. Hoa phong lan Cẩm báo không cần giá thể, dễ trồng.

Nhận diện lan cẩm báo bằng dấu hiệu như lá rất to bằng bàn tay và mọng nước, các rễ rất to không mọc trong chậu mà phun ra ngoài. Cẩm báo ra bông to và lâu tàn có thể đến 3 tuần mới tàn trong tự nhiên có một loài lan rất giống cẩm báo là lan râu mực.

cẩm báo đúng cách: Lan cẩm báo có bộ rễ khá dày và nhiều. Cây ưa ánh sáng dồi dào và môi trường thông thoáng khô ráo. Cây thích hợp nhất là được trồng trong những giá thể gỗ lũa được ghép thêm rễ dương xỉ và vỏ thông lớn dễ thoát nước, nhiệt độ nóng ấm, mùa hè tưới nuớc hàng ngày và bón phân hàng tuần.

Chăm sóc hoa phong lan cẩm báo: Lan cẩm báo thích hợp với điều kiện khí hậu khoảng từ 25-30 độ C. Các chậu lan này nên được trồng với độ ẩm cao tuy nhiên ẩm độ trong chậu cần được thoáng mát. Lan cẩm báo thuộc giống ưa sáng.

Trên thực tế môi trường giàu ánh sáng sẽ khiến cho lan nở hoa to và đẹp hơn. Cường độ ánh sáng nên ở mức 60% sáng là thích hợp nhất. Lan cẩm báo là một trong số những loại giống cây có nhu cầu về loại phân bón khá cao. Nên phòng ngừa sâu bệnh cho lan bằng cách định kì phun các loại thuốc ngừa nấm như , Benomyl nồng độ 1/400 khoảng nửa tháng 1 lần.

Lan Kim Tuyến Sapa có thân bò dài khoảng 12 – 20 cm, lá cây có màu đỏ nhạt cùng các gân nhỏ màu hồng. Cụm hoa nhỏ bao gồm các bông hoa hồng nhạt kết vào nhau. Có câu nói ngụ ý rằng chơi lan thì chơi lá rồi mới chơi hoa. Bởi vậy lan Kim Tuyến Sapa được săn đón nhờ vào hình thái lá rất đẹp.

Hoa thường nở vào tháng 10 – 12 hàng năm, ra chồi rồi hạt để tái sinh. Có thể tìm thấy hoa ở trong rừng sâu với độ cao 1500 – 1800 m. Khi chăm sóc lưu ý đến độ ẩm của cây vì lan là loài rất nhạy cảm, dễ sinh bệnh.

Đối với lan kim tuyến cách tốt nhất để phòng trừ sâu bệnh cho cây là phải đảm bảo độ ẩm cũng như các chất dinh dưỡng đầy đủ cho cây. Ngoài ra, bạn cũng nên thường xuyên kiểm tra hiện trạng của lan để phát dấu hiệu bệnh kịp thời, từ đó có cách phòng trị hiệu quả.Loại bỏ ngay những cây đã bị nhiễm bệnh để tránh lan sang các cá thể khác.

Về hình dáng thân lan có vùng bìu cũng như vùng thắt tạo thành hình giống như chuỗi phật trong phật giáo. Hoa trúc phật bà rất đẹp cánh hoa rất bay màu trắng tự nhiên dược bao bọc bởi viền màu tím, nhuỵ hoa rất tươi thể hiện sự trường tồn tạo nên tổng thể mặt hoa rất đẹp.

Khi trồng loài hoa lan đẹp này cần chú ý: giá thể trồng lan phật bà thường là vỏ thông trộn xơ dừa. Khi trồng nên để bộ rễ nằm trên giá thể vì nó không chịu được độ ẩm quá cao dễ gây bệnh trên cây.

– Sau khi đã có những cây lan Trúc Phật Bà ta tiến hành xử lý những cây khi mới mua về và bắt đầu ghép những cây lan Trúc Phật Bà vào gỗ hoặc chậu và đặt ở vị trí cố định.

– Tưới nước cho cây đủ ẩm và để cây ở khu vực có ánh nắng vừa phải để cây ra bộ rễ mới và phát triển.

– Ở khu vực miền bắc cây cần giữ độ ẩm tốt hơn và cần bổ sung lượng nước vừa phải, khi ở miền bắc khi có gió lạnh ta cần giảm lượng nước và cắt nước cho tới khi cây ra chồi mới, ta mới tiến hành chăm sóc tiếp.

Đây là một cái tên trong các loại hoa phong lan đẹp nhất hiện nay, được dùng làm cây cảnh trong những gia đình yêu hoa, thiên nhiên. Cây được tìm thấy ở Lâm Đồng trên độ cao 1400 – 2150 mét nên rất khó để sở hữu được lại hoa này.

Hoa mọc thành từng bông nhỏ, màu trắng pha một chút xanh lá phần cuống hoa. Thân cây khá to nên được dùng làm cây cảnh khá nhiều. Tuy nhiên do tình trạng săn bắt cao nên dần trở nên ít đi và có nguy cơ bị tuyệt chủng như các giống lan rừng quý hiếm khác.

Có một lưu ý nhỏ với những người chơi lan lần đầu đó là lan rừng hiện nay thường được ghép và nuôi tại vườn nên không phải chậu hoa nào cũng giữ được vẻ đẹp nguyên thủy của chúng. Là một người chơi lan lâu năm nhất định phải hiểu lan rừng đẹp nhất khi nó được ở đúng nơi – rừng sâu.

Tại Việt Nam, suốt mùa mưa từ tháng 4-6 cây lan lúc nào cũng ướt đẫm và lại rất khô vào mùa đông. Theo quy luật chung, tưới nhiều khi cây non mọc và bớt tưới vào mùa thu khi cây đã ngưng tăng trưởng. Mùa đông chỉ tưới sơ qua hoặc phun nước vào buổi sáng.

Khi thấy củ bị nhăn nheo hay lá bị héo, đó là dấu hiệu của sự thiếu nước và thiếu độ ẩm. Trái lại nếu củ lúc nào cũng mập tròn sẽ không ra hoa.Đừng bao giờ để lan bị khô rễ vào mùa hè và mùa xuân bắt đầu tưới trở lai khi thấy mọc rễ mới hay ra mầm non.

Bón phân 30-10-10 với dung lượng ¼-½ thìa cà phê cho 4 lít nước và đổi sang 10-30-20 khi bắt đầu mùa thu, hay có thể dùng phân 15-15-15 quanh năm với liều lượng như trên. Lan không ưa bị đọng muối trong chậu, cho nên mỗi tháng cần xả nước một lần cho sạch, tức là tưới như thường lệ và 1-2 giờ sau tưới thêm một lần nữa, rồi mới bón phân. Khi cây mọc mạnh bón mỗi tuần một lần, khi cây ngưng tăng trưởng bón mỗi tháng một lần.

Đặc điểm nổi bật nhất của cây phi điệp 5 cánh trắng chính là mặt bông hoa. Theo đó, khuôn bông có vẻ đẹp hài hoà, cánh đỉnh cao, vươn thẳng, đầu cánh hơi cong, hai cánh vai ngang, xếp đều nhau. Bên trong, môi hoa có hình tim, có nhung tuyết ở bờ môi và hai mắt nổi rõ màu tím.

Khác với các loại phi điệp thông thường các cánh hoa có màu tím, năm cánh của loại phi điệp này có màu trắng, trong như ngọc. Đặc biệt, sau khi nở từ 3 – 5 tiếng, hoa lan toả mùi hương rất quyến rũ, dễ chịu, thoang thoảng nhưng bay xa và có thể lôi kéo lòng người…

Vào mùa hè, lan phát triển manh cho nên tưới 2 đến 4 lần/ tuần. Vào mùa thu, bạn quan sát thấy cây tăng trưởng chậm thì tưới nước ít lại, giảm mức độ tưới xuống 1 lần/tuần để cây không thiếu nước và teo lại.

Mùa đông là thời gian lan chuẩn bị để ra hoa, hãy ngưng hẳn việc tưới nước. Nếu ẩm độ quá thấp nên phun sương mỗi tháng 1-2 lần.

– Ánh sáng:

Lan phi điệp cần nhiều ánh sáng gần như có thể để ở ngoài trời, nhưng cần phải có lưới che phòng khi lá non bị cháy nắng. Khi thấy cây quặt quẹo, đó là dấu hiệu thiếu nắng. Hãy đưa cây ra chỗ có nhiều nắng hơn. Nhất là vào mùa đông, nếu thiếu nắng cây khó lòng ra hoa.

– Nhiệt độ:

Lan cần nuôi trong nhiệt độ từ 40-80°F hay 8-25°C. Tuy nhiên, lan có thể chịu nóng tới 100°F hay 38°C và có thể chịu lạnh tới 38°F hay 3.3°C. Ngoài ra nếu vào mùa đông không lạnh dưới 50°F hay 15.6°C trong vòng 4-6 tuần lan sẽ khó lòng ra nụ.

– Đổ ẩm:

Lan phi điệp mọc mạnh nếu ẩm độ cần phải từ 60-70%. Nếu quá thấp cây non sẽ không lớn được và bị teo đi.

– Độ thoáng gió:

Cây cũng không mọc mạnh nếu không thoáng gió và trong thời kỳ lan ra nụ nếu không thoáng gió nụ sẽ ít đi.


【#5】Lan Kim Tuyến Ngâm Rượu: Làm Tiêu Tan Nỗi Sầu Chăn Gối

Lan kim tuyến có nhiều tên gọi khác nhau như lan gấm, nam trùng thảo, cỏ nhung, cây kim cương, giải thủy tơ, có tên khoa học là Anoectochilus setaceus Blume, thuộc họ Lan. Đây là một trong những loại dược liệu có giá trị cao và đặc biệt quý hiếm. Tuy nhiên do nhu cầu sử dụng quá cao, Lan kim tuyến đang đứng trước nguy cơ tuyệt chủng và được đưa vào sách đỏ Việt Nam và cần được bảo vệ.

Hiện nay cây Lan kim tuyến tại Việt Nam không được sử dụng nhiều vì đã quá khan hiếm, thường phân bố ở các tỉnh Tây Bắc như Tuyên Quang, Hòa Bình, Yên Bái, Lào Cai, Lai Châu, Cao Bằng,… Cây Lan kim tuyến hiện nay được sử dụng chủ yếu là nguồn dược liệu nhập khẩu từ nước ngoài.

Chế biến và thu hái

Lan kim tuyến được thu hái quanh năm tại một số quốc gia và được sử dụng để làm dược liệu. Khi thu hái, sản phẩm thường chỉ hái thân là chính, không đào lấy rễ để giúp cho cây có điều kiện tiếp tục phát triển. Cây được đem về để rửa sạch và phơi khô rồi mới làm dược liệu.

Lan kim tuyến chữa bệnh gì?

Thành phần hóa học của lan kim tuyến bao gồm các hoạt chất chính như beta-D-glucopyranosy, succinic acid, palmitic acid, stearic acid, beta-sitosterol và nhiều hoạt chất quý, các acid amin quý khác.

Theo Y học cổ truyền, lan kim tuyến có tính mát, hơi chát, vị ngọt, tác động chủ yếu vào can và tỳ. Một số công dụng chính của cây lan kim tuyến là điều trị các vấn đề như mất ngủ, bồi bổ cơ thể, giảm mệt mỏi căng thẳng, cải thiện bệnh tiểu đường và một số vấn đề về gan, cải thiện tình trạng xuất tinh sớm, di tinh, giảm đau nhức xương khớp, đau họng, tiêu đờm, ho khan.

Năm 2010 là thời điểm cây lan kim tuyến rộ lên cơn sốt mua lan kim tuyến của Đài Loan từ các quốc gia như Việt Nam, Trung Quốc. Cây lan kim tuyến có giá rất cao và dao động tùy thời điểm dựa theo độ hiếm trong thời điểm đó. Giá cây lan kim tuyến có thể dao động trong khoảng từ 3,5 – 4 triệu đồng/kg, ngoài ra có thời điểm đạt đỉnh từ 10 – 12 triệu/kg tươi vào những thời điểm khan hiếm nguồn nguyên liệu.

Cách ngâm rượu lan kim tuyến

Lan kim tuyến có thể sử dụng bằng cách ngâm rượu để bồi bổ cho cơ thể, tăng cường hệ miễn dịch cũng như sinh lý. Bạn có thể thực hiện theo các cách sau:

  • Lan kim tuyến tươi 1 kg (nếu lan kim tuyến khô dùng 500g).
  • Rượu trắng khoảng 3 lít.
  • Bình thủy tinh ngâm rượu (không nên dùng bình nhựa vì trong quá trình ngâm rượu sẽ ảnh hưởng không tốt đến sức khỏe).
  • Lan kim tuyến rửa sạch.
  • Để ráo nước.
  • Đem ngâm với lan kim tuyến với khoảng 3 lít rượu 40 độ là dùng được.
  • Ngâm trong thời gian 1 tháng là dùng được.
  • Có thể sử dụng khoảng 50 ml rượu sau bữa ăn để cải thiện sức khỏe. Không sử dụng nhiều hơn 50 ml/ngày sẽ ảnh hưởng đến sức khỏe.

Lưu ý khi sử dụng lan kim tuyến

  • Lan kim tuyến là một loại dược liệu tốt cho sức khỏe, tuy nhiên khi sử dụng, bạn cũng cần tuân thủ liều lượng phù hợp, nếu không sẽ ảnh hưởng không tốt đến sức khỏe.
  • Không nên sử dụng cho phụ nữ mang thai và trẻ nhỏ.
  • Trước khi ngâm rượu cần xem xét kỹ tình trạng cây lan kim tuyến để tránh sử dụng phải các sản phẩm biến chất, bị mốc,…

【#6】Luận Văn: Nghiên Cứu Nhân Nhanh In Vitro Loài Lan Kim Tuyến, 9Đ

Published on

Download luận văn thạc sĩ ngành sinh học thực nghiệm với đề tài: Nghiên cứu nhân nhanh in vitro loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) nhằm bảo tồn nguồn dược liệu quý, cho các bạn tham khảo

  1. 3. LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực tập tốt nghiệp và hoàn thành luận văn, em đã nhận được sự giúp đỡ về nhiều mặt của các cấp lãnh đạo, các tập thể và các cá nhân. Trước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến chúng tôi Nguyễn Trung Thành, thầy đã luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này. Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy chúng tôi Nguyễn Quang Thạch và toàn thể tập thể cán bộ phòng Công nghệ tế bào Thực vật, viện Sinh học Nông nghiệp, Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện về cơ sở vật chất, chia sẻ kinh nghiệm quý báu để em hoàn thành tốt đề tài này. Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới gia đình, người thân và bạn bè đã cổ vũ, động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 5 tháng 12 năm 2012 Học viên Phí Thị Cẩm Miện
  2. 4. DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BAP 6-benzylaminopurin CT Công thức CV% Hệ số biến động (Correlation of Variance) ĐC Đối chứng IBA indol-3-acetic acid MS Murashige và Skoog, 1962 LSD0,05 Sai khác tối thiểu có ý nghĩa ở P – 0,5 (Leant Significant Difference) ND Nước dừa αNAA α-naphthylacetic acid
  3. 5. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN………………………………………………………………………………………. 1 MỤC LỤC …………………………………………………………………………………………… 5 MỞ ĐẦU …………………………………………………………………………………………….. 7 1.1. Đặt vấn đề ……………………………………………………………………………………… 7 CHƯƠNG I………………………………………………………………………………………….. 8 TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………………………………………………….. 8 1.1. Giới thiệu chung về cây Lan Kim tuyến ……………………………………………… 8 1.1.1. Đặc điểm hình thái ……………………………………………………………………….. 9 1.1.2. Đặc điểm phân bố……………………………………………………………………….. 11 1.2. Nhân giống cây Lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus) ……………………. 13 1.2.1. Nhân giống bằng hạt …………………………………………………………………… 13 1.2.2. Nhân giống bằng cây con …………………………………………………………….. 13 1.2.3. Phương pháp giâm cây………………………………………………………………… 14 1.2.4. Nhân giống in vitro……………………………………………………………………… 14 1.2.4.1. Cơ sở khoa học của nhân giống in vitro ………………………………………. 14 1.2.4.2. Ý nghĩa của nhân giống in vitro………………………………………………….. 15 1.2.4.3. Các phương thức nhân giống vô tính…………………………………………… 18 1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy……………………………………………………. 18 1.3.1. Ảnh hưởng của điều kiện khử trùng mẫu cấy…………………………………… 18 1.3. 2. Ảnh hưởng của các thành phần hóa học………………………………………… 19 1.3. 3. Ảnh hưởng của các yếu tố vật lý…………………………………………………… 23 1.3.4. Ảnh hưởng của điều kiện ra cây ……………………………………………………. 24 1.4. Quy trình sản xuất cây cấy mô…………………………………………………………. 25 1.5. Tình hình nghiên cứu trên cây Lan Kim tuyến……………………………………. 26 1.5.1.Tình hình nghiên cứu trên thế giới………………………………………………….. 26 1.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước…………………………………………………… 27 CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………………. 28 2.1. Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu …………………………. 28 2.2. Mục tiêu nghiên cứu………………………………………………………………………. 28 2.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn …………………………………………………………. 29
  4. 6. 2.4. Nội dung nghiên cứu ……………………………………………………………………… 29 2.5. Phương pháp nghiên cứu………………………………………………………………… 29 2.5.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm……………………………………………………… 30 2.5.2. Phương pháp đánh giá kết quả và xử lý số liệu………………………………… 35 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……………………………………….. 39 3.1. Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu sạch và xác định cơ quan vào mẫu phù hợp cho việc nhân nhanh in vitro…………………………………………… 39 3.1.1. Xác định chất khử trùng thích hợp …………………………………………….. 39 3.1.2. Xác định cơ quan vào mẫu thích hợp để tạo mẫu sạch và tăng hệ số nhân chồi in vitro……………………………………………………………………………….. 42 3.1.2.1. Ảnh hưởng của loại vật liệu đến tỷ lệ tạo mẫu sạch……………………….. 42 3.1.2.2. Ảnh hưởng của cơ quan vào mẫu đến hệ số nhân chồi in vitro ……….. 44 3.2. Nghiên cứu môi trường khởi động và nhân nhanh thích hợp…………… 45 3.2.1. Xác định môi trường nền thích hợp cho nuôi cấy mô Lan Kim tuyến (A. setaceus) ……………………………………………………………………………………………. 45 3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất điều hòa sinh trưởng riêng rẽ và phối hợp đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân…………………………………….. 47 3.2.2.1. Ảnh hưởng của nhóm chất Cytokinin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân………………………………………………………………………………………………….. 47 3.2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA và αNAA đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân Lan Kim tuyến (A. setaceus)………………………………………………….. 50 3.2.2.3.Ảnh hưởng của sự phối hợp 2 nhóm chất là auxin và cytokinin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân…………………………………………………………… 53 3.3. Nghiên cứu ra rễ tạo cây hoàn chỉnh…………………………………………………. 56 3.3.1. Ảnh hưởng của môi trường nền (môi trường không có chất điều tiết sinh trưởng) đến sự ra rễ…………………………………………………………………………….. 56 3.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến sự ra rễ…………………….. 58 CHƯƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ …………………………………………… 67 4.1. Kết luận………………………………………………………………………………………. 67 4.2. Đề nghị ……………………………………………………………………………………….. 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………………………….. 69 PHỤ LỤC ………………………………………………………………………………………….. 75
  5. 7. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Từ xưa đến nay, lan vẫn được biết đến như một loài hoa quý phái, hoa của bậc vua chúa vương giả. Lan được phát hiện đầu tiên vào những năm 40 của thế kỷ VIII, cho đến nay đã có hơn 15.000 loại lan trồng khác nhau trên trên thế giới. Tại Việt Nam, hoa lan cũng vô cùng đa dạng phong phú, có khoảng hơn 1.000 loài hoa các loại, chúng sinh sản tại các vùng rừng, núi như Cao Bằng, Lào Cai, Huế, Quy Nhơn, Đà Lạt, Pleiku, … lan Việt Nam đẹp thanh cao lại chứa đựng nhiều ý nghĩa, có rất nhiều cây quý hiếm và có những cây trước kia chỉ thấy mọc ở Việt Nam (như lan nữ hài Paphiopedilum delenati). Họ lan (Orchidaceae) là một trong số những họ thực vật đa dạng nhất của Việt Nam, với tổng số khoảng 865 loài thuộc 154 chi. Thông thường lan được sử dụng làm cảnh. Ngoài ra, có nhiều loài lan còn được sử dụng làm thuốc. Chi lan Kim tuyến Anoectochilus ở Việt Nam hiện thống kê được 12 loài, trong đó có loài lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume, tên khác Anoectochilus roxburghii Wall. ex Lindl. phân bố rộng ở hầu hết các tỉnh trong cả nước, được biết đến nhiều không những bởi giá trị làm cảnh, mà bởi giá trị làm thuốc của nó. Do bị thu hái nhiều để bán làm thuốc từ rất lâu, nên loài lan Kim tuyến đang bị đe dọa nghiêm trọng, rất có thể sẽ bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên nếu chúng ta không có biện pháp bảo tồn hữu hiệu. Hiện nay, lan Kim tuyến được cấp báo trong Nghị định 32/2006/NĐ-CP thuộc nhóm IA, nghiêm cấm khai thác sử dụng vì mục đích thương mại và nhóm thực vật rừng đang nguy cấp EN A1a,c,d, trong sách đỏ Việt Nam 2007. Vì vậy, nghiên cứu kỹ thuật nhân giống loài lan Kim tuyến – Anoectochilus setaceus Blume được triển khai sẽ cung cấp những cơ sở khoa học và thực tiễn để tạo ra hàng loạt những cây con ổn định về mặt di truyền nhằm bảo tồn và phát triển loài dược liệu nguy cấp, quí hiếm này. Xuất phát từ những cơ sở đó, chúng tôi đã lựa chọn và thực hiện nghiên cứu đề tài:”Nghiên cứu nhân nhanh in vitro loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) nhằm bảo tồn nguồn dược liệu quý”.
  6. 8. CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về cây Lan Kim tuyến Chi lan Kim tuyến (Anoectochilus) còn được gọi là lan trang sức vì vẻ đẹp hấp dẫn của nó, được Carlvon Blume mô tả đầu tiên năm 1810 thuộc phân họ Orchidoideae. Trên thế giới đã thống kê được 51 loài. Ở Việt Nam hiện thống kê được 12 loài, trong đó loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) được biết đến chủ yếu với công dụng làm thuốc. Lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) Đồng danh là (Anoectochilus roxburghi Wall.) Họ: Phong lan (Orchidaceae) Bộ: Phong lan (Orchidales) Đây là loài đơn thân, mọc ở đất, có thân rễ mọc dài; thân trên đất mọng nước và có nhiều lông mềm, mang 2 – 4 lá mọc xoè sát đất. Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, chóp hơi nhọn và có mũi ngắn, cỡ 3 – 4 x 2 – 3 cm, mặt trên màu nâu thẫm có vệt vàng ở giữa và màu hồng nhạt trên các gân, mặt dưới màu nâu nhạt. Cuống lá dài 2 – 3 cm. Cụm hoa dài 10 – 15 cm, mang 4 – 10 hoa mọc thưa. Lá bắc hình trứng, dài 8-10 mm, màu hồng. Hoa thường màu trắng, dài 2,5 – 3 cm; môi dài đến 1,5 cm, ở mỗi bên gốc mang 6 – 8 dải hẹp, chẻ đôi thành 2 thuỳ hình thuôn tròn. Bầu dài 13mm, có lông thưa. Mùa hoa tháng 2, tháng 4. Tái sinh bằng chồi từ thân rễ và hạt ít, sinh trưởng rất chậm. Là loại cây ưa bóng, kỵ ánh sáng trực tiếp thường mọc dưới tán rừng nguyên sinh, rừng rậm nhiệt đới ở độ cao 500 – 1600m. Mọc rải rác vài ba cây trên đất ẩm, giàu mùn và lá cây rụng. Phân bố: Việt Nam: Lào Cai (Sapa), Hà Giang (Quản Bạ), Yên Bái, Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Hà Tây (Mỹ Đức: Chùa Hương), Quảng Trị (Đồng Chè), Kontum (Đắc Tô: Đắc Uy), Gia Lai (Kbang: Kon Hà Nừng)….Thế giới: Trung Quốc (Vân Nam, Quảng Đông), Ấn Độ, Lào, Inđônêxia,… Tác dụng dược lý: Lan Kim tuyến là loài cây thuốc rất đặc biệt có tác dụng tăng cường sức khoẻ, làm khí huyết lưu thông, có tính kháng khuẩn, chữa các bệnh viêm khí quản, viêm gan mãn tính, chữa suy nhược thần kinh. Loài lan này được dùng làm thuốc chữa bệnh trị lao phổi, phong thấp, đau nhức khớp xương, viêm dạ dày mãn tính (Nguyễn Tiến Bân, Dương Đức Huyến). Trước đó, lan Kim tuyến (A. setaceus) là một trong những dược thảo quý giá, giúp bổ máu,
  7. 9. dưỡng âm, chữa trị nóng phổi và nóng gan (Tạ A Mộc và Trần Kiến Đào, 1958). Hơn nữa mới đây người ta đã phát hiện ra khả năng phòng và chống ung thư của loại thảo dược này. Theo các tài liệu nghiên cứu của Trung Quốc công bố gần đây bằng kỹ thuật sắc ký lỏng, sắc ký cột và kỹ thuật quang phổ đã phân lập, xác định được cấu trúc hoá học và thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất có trong loài lan Kim tuyến (Tạp chí “Sinh học thực vật tổng hợp Trung Quốc”, tập 48 số 3, tháng 3/2006, trang 359-363). Bằng các kỹ thuật quang phổ đã xác định được 8 hợp chất hoá học. Các hợp chất này đều có hoạt tính sinh học mạnh, có khả năng làm giảm các gốc tự do trong cơ thể, nên có khả năng phòng bệnh rất tốt. Đặc biệt có hai axít hữu cơ được phân lập là Olenolic acid và Ursolic acid có khả năng chống ung thư, giảm cholesterol máu, chống tăng huyết áp, kháng khuẩn… 1.1.1. Đặc điểm hình thái Lan Kim tuyến là cây thảo, mọc ở đất, có thân rễ mọc dài; thân trên đất mọng nước, mang các lá mọc xòe sát đất. a. Thân rễ Lan Kim tuyến là cây thân rễ nằm ngang sát mặt đất, đôi khi hơi nghiêng, bò dài. Chiều dài thân rễ từ 5-12 cm, trung bình là 7,87 cm. Đường kính thân rễ từ 3-4 mm, trung bình là 3,17 mm. Số lóng trên thân rễ từ 3-7 lóng, trung bình là 4,03 lóng. Chiều dài của lóng từ 1-6 cm, trung bình là 1,99 cm. Thân rễ thường có màu xanh trắng, đôi khi có màu nâu đỏ, thường nhẵn, không phủ lông. b. Thân khí sinh Cây lan Kim tuyến có thân khí sinh thường mọc thẳng đứng trên mặt đất, ít khi mọc nghiêng. Chiều dài thân khí sinh từ 4-8 cm, trung bình 6 cm. Đường kính thân khí sinh từ 3- 5 mm, trung bình là 3,08 cm. Thân khí sinh mang nhiều lóng, các lóng có chiều dài khác nhau. Số lóng trên thân khí sinh thay đổi từ 2-4 lóng, trung bình là 2,87. Chiều dài mỗi lóng từ 1-4 cm, trung bình 2,23 cm. Thân khí sinh thường mọng nước, nhẵn, không phủ lông; thường có màu xanh trắng, đôi khi có màu hồng nhạt. c. Rễ Rễ lan Kim tuyến được mọc ra từ các mẫu trên thân rễ. Đôi khi rễ cũng được hình thành từ thân khí sinh. Rễ thường đâm thẳng xuống đất. Thông thường mỗi mẫu chỉ có một rễ, đôi khi có vài rễ cùng được hình thành từ một
  8. 10. mấu trên thân rễ. Số lượng và kích thước rễ cũng rất thay đổi tuỳ theo cá thể. Số rễ trên một cây thường từ 3 – 10, trung bình là 5,4. Chiều dài của rễ thay đổi từ 0,5 – 8 cm, rễ dài nhất trung bình là 6,07cm và ngắn nhất trung bình là 1,22 cm, chiều dài trung bình của các rễ trên một cây là 3,82 cm. d. Lá Lá lan Kim tuyến mọc cách xoắn quanh thân, xoè trên mặt đất. Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, đầu lá hơi nhọn và có mũi ngắn, thường dài từ 3 – 5 cm, trung bình là 4,03 cm và rộng từ 2 – 4 cm, trung bình là 3,12 cm. Lá có màu nâu đỏ ở mặt trên và phủ lông mịn như nhung. Hệ gân lá mạng lưới lông chim, thường có 5 gân gốc. Các gân này thường có màu hồng ở mặt trên và nổi rất rõ. Đôi khi gân ở giữa có màu vàng nhạt. Mặt dưới lá có màu nâu đỏ nhạt, nhẵn với 5 gân gốc nổi rõ. Các gân bên ở phía rìa lá nổi rõ, gân ở giữa lá ở mặt dưới không rõ. Cuống lá dài 0,6 – 1,2 cm, thường nhẵn và có màu trắng xanh, đôi khi hơi đỏ tía ở bẹ lá. Bẹ lá nổi rõ và nhẵn. Số lá trên một cây thay đổi từ 2 – 6, thông thường có 4 lá. Kích thước của lá cũng thay đổi, các lá trên một cây thường có kích thước khác nhau rõ rệt. e. Hoa, quả Hoa lan Kim tuyến dạng cụm, dài 10 – 20 cm ở ngọn thân, mang 4 – 10 hoa mọc thưa. Lá bắc hình trứng, dài 6 – 10 mm, màu hồng. Các mảnh bao hoa dài khoảng 6 mm; cánh môi màu trắng, dài đến 1,5 cm, ở mỗi bên gốc mang 6 – 8 dải hẹp, đầu chẻ đôi. Mùa hoa tháng 10 – 12. Mùa quả chín tháng 12 – 3 năm sau.
  9. 11. Hình 2.1. Cây (A) và hoa (B) lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume 1.1.2. Đặc điểm phân bố 1.1.2.1. Phân bố theo kiểu rừng: Kết quả điều tra đã chỉ ra rằng, hiện nay lan Kim tuyến hầu hết phân bố ở kiểu rừng kín lá rộng thường xanh á nhiệt đới núi thấp, cấu trúc rừng thường có 2 tầng cây gỗ. Đôi khi có thể gặp lan Kim tuyến ở kiểu rừng kín lá rộng thường xanh mưa mùa nhiệt đới. – Tầng ưu thế sinh thái A2: Độ tán che thường từ 85-90%, với các loài cây gỗ chủ yếu như: Chắp tay bắc bộ (ExbuckLandia tonkinensis), Chắp tay (ExbuckLandia populnea), Thích các loại (Acer spp.), Trương vân (Toona surenii), Gội nếp (Aglaia spectabilis), Trám trắng (Canarium album), Kháo thơm (Machilus odoratissima), Sồi phảng (Lithocarpus cerebrinus), Dẻ gai bắc bộ (Castanopsis tonkinensis), Trâm trắng (Syzygium chanlos), Côm tầng (Elaeocarpus griffithii), Trâm tía (Syzygium sp.), Vỏ sạn (Osmanthus spp.), Thừng mực mỡ (Wrightia laevis), Máu chó (Knema spp.), v.v. Chiều cao của tầng A2 từ 15-25 m. – Tầng cây gỗ A3: Bao gồm các loài cây của tầng trên còn nhỏ và các loài cây của tầng dưới như: Hoa trứng gà (Magnolia coco), Trứng gà 3 gân (Lindera sp.), Phân mã tuyến nổi (Archidendron chevalieri), Phân mã (Archidendron balansae), Mắc niễng (Eberhardtia tonkinensis), Nanh chuột (Cryptocarya lenticellata), Re hương (Cinnamomum iners), Re bầu (Cinnamomum Thân khí sinh Thân ngầm A B
  10. 12. bejolghota), Mò roi (Litsea balansae), Trà hoa vàng (Camelia spp.), Xoan đào (Prunus arborea), Trọng đũa (Ardisia spp.), v.v. Chiều cao của tầng A3 từ 8- 15m. – Tầng cây bụi B: Gồm các loài thực vật như Mua đất (Melastoma sp.), Ớt sừng lá nhỏ (Kibatalia mycrophylla), Lấu (Psychotria rubra), Ớt rừng (Clausena sp.), Bọt ếch (Glochidion hirsutum), v.v… – Tầng cỏ quyết: Bao gồm chủ yếu các loài Thường sơn (Dichroa febrifuga), Cao cẳng (Ophiopogon spp.), Gừng một lá (Zingiber monophyllum), Giềng tàu (Alpinia chinensis), Sẹ (Alpinia tonkinensis), Mía dò (Costus speciosus), Mía dò bắc bộ (Costus tonkinensis), Râu hùm (Tacca spp.), Cỏ lá tre (Centosteca latifolia), Rớn đen (Adiantum flabellulatum), Hèo (Calamus rhabdocladus), Lòng thuyền (Curculigo gracilis), Móc (Caryota mitis), v.v… – Thực vật ngoại tầng: Bao gồm các loài thuộc chủ yếu các họ Mã Tiền (Loganiaceae), họ Cau (Arecaceae), họ Na (Annonaceae), họ Kim cang (Smilacaceae), họ Củ nâu (Dioscoreaceae), họ Cà phê (Rubiaceae), họ Đậu (Fabaceae), họ Vang (Caesalpiniaceae), họ Trinh nữ (Mimosaceae), họ Ráy (Araceae), họ Thiên lý (Asclepiadaceae), họ Bòng bong (Schizaeaceae). Điển hình như: Dây hoa dẻ (Desmos chinensis), Dây dất na (Desmos spp.), Dây kim cang các loại (Smilax spp.), Củ nâu (Dioscorea cirrhosa), Móc câu đằng (Uncaria sp.), Ráy leo (Pothos scandens), Dây sưa (Dalbergia candenatensis), Dây móng bò (Bauhinia sp.), Bòng bong các loại (Ligodium spp.), Dây thèm bép (Tetrastigma rupestre), v.v… – Mật độ phân bố: Của Lan Kim tuyến ở đây là rất thấp, trung bình khoảng 20 cây/ha. Chúng phân bố rải rác ở một số điểm thuộc khu vực nghiên cứu. 1.1.2.2. Phân bố lan Kim tuyến theo trạng thái rừng và sinh cảnh – Theo trạng thái rừng: Kết quả điều tra đã khẳng định, lan Kim tuyến phân bố tập trung chủ yếu ở trạng thái rừng IIIA2, thuộc vùng lõi của Vườn quốc gia. Độ tán che của trạng thái rừng này từ 85-90%. Đặc điểm của cây bụi và thảm tươi ở khu vực Lan Kim tuyến phân bố là thưa thớt, độ che phủ thấp thường vào khoảng từ 15-30%, với độ cao của lớp cây bụi và thảm tươi khoảng từ 0,1-0,5m tuỳ từng khu vực. Lan Kim tuyến thường ít phân bố ở những nơi cây bụi thảm tươi dày đặc. Chúng có thể nằm ngay trên lớp thảm mục của rừng đang bị phân huỷ.
  11. 13. – Về sinh cảnh: Lan Kim tuyến chủ yếu phân bố trên đất, chúng mọc sát ngay bề mặt đất, nơi đất giàu mùn, độ ẩm và độ xốp cao, thoáng khí; thậm chí ngay trên lớp thảm mục của rừng đang phân huỷ. Đôi khi chúng mọc trên các tảng đá ẩm, trên các đoạn thân cây gỗ mục, trong gốc cây. Có thể bắt gặp lan Kim tuyến ở trong rừng nơi ẩm ướt, ven các khe suối, dưới tán rừng cây gỗ lớn, hoặc dưới rừng trúc, rừng sặt, trên đường mòn đi lại trong rừng. 1.1.2.3. Phân bố lan Kim tuyến theo địa lý, địa hình và đai cao – Về địa lý, địa hình: Có thể gặp chúng ở hầu hết các dạng địa hình, như chân núi, sườn núi, đỉnh núi. – Về đai cao: Lan Kim tuyến thường phân bố ở đai cao trên 735m, tập trung chủ yếu ở độ cao trên 970m, quanh núi Rùng Rình. 1.2. Nhân giống cây lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus) 1.2.1. Nhân giống bằng hạt Nhân giống bằng hạt hay con gọi là nhân giống hữu tính, trong thiên nhiên sự thụ phấn của lan do côn trùng thực hiện, cấu trúc hoa hoàn toàn thích ứng với sự thụ phấn đó. Hoa lan là một loại hoa lưỡng tính, nhưng do cấu trúc của hoa và sự chín của các cơ quan sinh dục trong hoa không đều nên sự giao phấn nhờ sâu bọ có tính bắt buộc đối với tất cả các loài setaceus. Sự thụ phấn của hoa trong môi trường tự nhiên được côn trùng thực hiện trên cơ sở của mùi thơm, mật, màu sắc sặc sỡ và những cấu tạo của hoa là những nhân tố chính để thu hút các tác nhân thụ phấn từ khoảng cách xa. Ở vườn nuôi trồng lan để đảm bảo kết quả của sự giao phấn cao và tạo ra các giống lai theo ý muốn, con người phải tiến hành thụ phấn nhân tạo. Sự thụ phấn có thể cùng cây, có thể khác cây. Phương pháp này có nhiều ưu điểm: Dễ làm, giá thành hạ, thu được nhiều cây khoẻ, không bị bệnh, ngoài ra do đặc điểm giao phấn chéo có thể thu được những dòng biến dị cho vật liệu chọn tạo giống. Tuy nhiên trong thực tế hạt Lan Kim tuyến rất hiếm, số lượng hạt rất nhiều nhưng tỉ lệ nảy mầm ít, hơn nữa thời gian khá lâu để cây ra hoa có chất lượng tốt. 1.2.2. Nhân giống bằng cây con Khi rễ cây con tương đối nhiều, cây có từ 3-5 lá, cây cứng cáp có thể tách để trồng riêng. Đây là cách nhân giống đơn giản và dễ làm nhất.
  12. 14. 1.2.3. Phương pháp giâm cây Lấy một giả hành cắt ra làm nhiều đoạn, mỗi đoạn có nhiều mấu. Đặt các đoạn này vào một nơi ẩm; chỉ cần cát và rêu. Sau vài tuần sẽ xuất hiện những cây con có thể đem trồng vào các chậu mới. Phương pháp này là phương pháp cổ điển, dễ làm, quen với tập quán, kinh nghiệm của người lao động, giá thành thấp. Tuy nhiên phương pháp này cũng có một số trở ngại như: chậm (tăng khoảng 2-4 cây/năm), chất lượng giống không cao, cây hoa trồng lâu bị thoái hoá, bệnh virus có nhiều khả năng lan truyền và phát triển, từ đó làm giảm phẩm chất hoa (Nguyễn Xuân Linh, 1998)[5a]. 1.2.4. Nhân giống in vitro Nhân giống in vitro là một trong 4 lĩnh vực ứng dụng chính của công nghệ tế bào thực vật và đã mang lại hiệu quả kinh tế lớn nhất (Lê Trần Bình, 1997) Kỹ thuật nhân nhanh in vitro nhằm phục vụ các mục đích sau: Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm và làm vật liệu cho công tác tạo giống. Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các loại cây trồng khác nhau như cây lương thực có củ, các loại cây rau, cây hoa, cây cảnh, cây dược liệu thuộc nhóm thân thảo. Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quý của giống cây lâm nghiệp và gốc ghép trong nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh thuộc nhóm cây thân gỗ. Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng và cách ly tái nhiễm kết hợp với làm sạch virus. Bảo quản các tập đoàn giống nhân vô tính và các loại cây giao phấn trong ngân hàng gen. 1.2.4.1. Cơ sở khoa học của nhân giống in vitro Tính toàn năng của tế bào (totipotency), từ năm 1902 nhà khoa học người Đức HaberLandt đã đề xướng ra phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh cho tính toàn năng của tế bào thực vật. Theo ông, mỗi tế bào được lấy từ bất kỳ cơ quan sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Khả năng này do mỗi tế bào đều chứa bộ gen mang thông tin di truyền của toàn bộ cơ thể, khi được đặt vào môi trường thích hợp tế bào này sẽ có khả năng giống như một hợp tử ban đầu.
  13. 15. Một đặc tính quan trọng khác, làm cơ sở cho nuôi cấy mô tế bào thực vật là khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào. Khả năng biệt hóa là sự biến đổi của tế bào từ tế bào phôi thành toàn bộ các tế bào chức năng trong các cơ quan của cơ thể. Ngược lại, khi được đặt vào môi trường thích hợp, các tế bào chuyên hóa của cơ thể có thể trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên sinh ra nó – tế bào phôi. Tuy nhiên, thực tế nghiên cứu đã chứng minh, khả năng phản biệt hóa của các tế bào là khác nhau, các tế bào chuyên hóa sâu như tế bào của hệ thống mạch dẫn thực vật, tế bào thần kinh động vật, khả năng biệt hóa rất khó xảy ra. Đối với thực vật, khả năng hình thành cơ quan hay cơ thể giảm dần theo chiều từ ngọn xuống gốc (Galson, 1986; Murashige, 1974). Trong tự nhiên, tất cả các loài sinh vật đều tồn tại trong mình tiềm năng sinh sản dù là vô tính hay hữu tính, như thế các loài mới có thể duy trì được kiểu gen của mình, chiến thắng trong quá trình tiến hóa. Nhưng ngay từ khi ra đời, công nghệ nuôi cấy mô đã trở thành công cụ đắc lực phục vụ mục đích nhân giống của con người. Vậy tại sao lại phải tiến hành nhân giống in vitro? Chúng ta hãy xem xét những ý nghĩa to lớn mà nó mang lại cho nhân loại. 1.2.4.2. Ý nghĩa của nhân giống in vitro Nuôi cấy mô tế bào thực vật, thực chất là một phương pháp nhân giống vô tính. Đối với nhiều loại thực vật quý hiếm, có giá trị kinh tế và ý nghĩa sinh học cao, gặp khó khăn trong vấn đề nhân giống hữu tính thì nhân giống vô tính in vitro là công cụ vô cùng hữu ích. Nhưng trên thực tế có nhiều loại thực vật nhân giống hữu tính bằng hạt có hệ số nhân cao nhưng vẫn tiến hành nhân giống vô tính in vitro là do: Các phương pháp nhân giống hữu tính bằng hạt mặc dù cho hệ số nhân giống cao, dễ bảo quản và vận chuyển nhưng với một số cây trồng, khi nhân giống bằng hạt sẽ cho các cây con không hoàn toàn giống bố mẹ cả về hình thái và thành phần hóa học (Calson, 1964). Sự không đồng nhất này gây ra khó khăn trong việc đưa cây vào sản xuất theo dây truyền công nghiệp, vì các cây có chất lượng sản phẩm không đồng đều, làm giảm giá trị thương phẩm. Đặc biệt, đối với các cây thuốc thì việc không đồng nhất về chất lượng hay chính là hàm lượng các chất hoạt tính sẽ dẫn đến hậu quả là nguyên liệu không ổn định, không đáp ứng được nhu cầu sản xuất. Ví dụ: đối với các cây lấy tinh dầu, việc nhân giống bằng hạt dẫn tới sự phân ly không đều về hàm lượng các thành phần hoạt chất. Theo Nilov (1936), cây Lavanda khi nhân giống bằng hạt, hàm lượng
  14. 16. tinh dầu ở cây con phân ly từ 0,5 đến 11,3 %, hàm lượng lynalylacetat từ 11 đến 78 %; cây bạc hà nhân giống hữu tính có sự phân ly rất lớn về hàm lượng và thành phần tinh dầu (Bùi Thị Hằng, Popov, 1975; Bogonina, 1969; Murray, 1960)… Để khắc phục những nhược điểm trên, phương pháp nhân giống vô tính được áp dụng đã mang lại nhiều hiệu quả kinh tế và ý nghĩa sinh học lớn. Phương pháp nhân giống vô tính đã khắc phục được nhiều nhược điểm của nhân giống hữu tính, ưu điểm lớn nhất của nhân giống vô tính là các cây con đồng đều về mặt di truyền do duy trì được các tính trạng của cây mẹ (Petrop, 1989), nên có thể áp dụng sản xuất đại trà cho sản phẩm có chất lượng ổn định; rút ngắn thời gian từ khi trồng đến thu hoạch tạo điều kiện cho tăng vụ, tăng sản lượng đối với những cây có thời gian nảy mầm của hạt kéo dài… Mặc dù vậy, phương pháp nhân giống vô tính truyền thống (chiết, giâm, ghép) vẫn còn nhiều nhược điểm như sự lây nhiễm bệnh qua nguyên liệu thường phổ biến và phức tạp, hệ số nhân thấp: cam thảo là 5 – 7 (Shah, Dalal, 1980), bạc hà piperita là 2-3 (Foldeli, Havas, 1979), … hơn nữa, việc sử dụng chính các bộ phận làm thuốc để nhân giống rất lãng phí, tốn kém. Để khắc phục các nhược điểm của phương pháp nhân giống vô tính truyền thống, một phương pháp nhân giống khác đã áp dụng rộng rãi trên thế giới cũng như ở Việt Nam, đó là phương pháp nhân giống in vitro, phương pháp này có nhiều ưu điểm nổi trội như: – Hệ số nhân giống cao, từ một cây trong vòng một năm có thể tạo thành hàng triệu cây. Hệ số nhân giống ở các loại cây khác nhau nằm trong phạm vi 36 đến 1012 / năm, cao hơn bất cứ phương thức nhân giống nào. Ví dụ: từ một củ khoai tây, sau 8 tháng nhân giống người ta thu được 2000 triệu củ đồng nhất di truyền, được trồng trên một vùng rộng 40 ha, có nghĩa là tốc độ nhân giống vô tính lớn hơn 100.000 lần so với sinh sản hữu tính (Senez, 1987). – Tính đồng nhất và ổn định di truyền cao: Các cây con được tạo ra giống hệt với cây bố mẹ ban đầu. Theo lý thuyết từ bất kỳ một cây chọn lọc ưu việt nào đều có thể tạo ra một quần thể với độ đồng đều cao, số lượng không hạn chế. – Nâng cao chất lượng giống do tạo được các giống sạch bệnh, loại bỏ được các nguồn vi khuẩn, virus, nấm bệnh. Trong công tác nhân giống, vấn đề được quan tâm hàng đầu là số lượng và chất lượng giống. Bằng phương pháp
  15. 18. cuối cùng là tái sinh cây hoàn chỉnh nhưng không phải chỉ có một phương thức chung cho tất cả các thực vật. 1.2.4.3. Các phương thức nhân giống vô tính in vitro Quá trình thực hiện nhân giống in vitro tạo ra các dòng vô tính, theo Shull (1912) dòng vô tính là một nhóm cá thể có kiểu gen tương tự nhau, chúng được nhân bằng sinh sản vô tính, các dòng vô tính này sẽ được tạo ra theo các phương thức sau: – Tái sinh cây trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng, phôi, ngọn chồi, chồi nách. – Tái sinh cây gián tiếp thông qua giai đoạn hình thành mô sẹo. * Tái sinh cây trực tiếp từ mẫu nuôi cấy là quá trình phát động những điểm tồn tại sẵn có trong mô nuôi cấy, phân chia và tái sinh thành cây. Các cây con này được phát sinh từ các đỉnh sinh trưởng có bộ nhiễm sắc thể 2n, hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền và duy trì được các tính trạng của cây mẹ (Hu and Xang, 1983). Tái sinh trực tiếp cũng có thể xuất phát từ những tế bào không nằm trên đỉnh sinh trưởng, đó là các đoạn thân, mảnh lá, cuống lá, mảnh hoa… Trong trường hợp này, các tế bào thường phân chia nhưng không hình thành các tế bào mô sẹo mà tạo thành các điểm sinh trưởng cao hơn ở trường hợp nói trên. * Con đường tái sinh gián tiếp, mẫu cấy khi nuôi trong môi trường thích hợp, thường là với auxin, có thể đem lại sự gia tăng thành khối tế bào không tổ chức, đó chính là các tế bào mô sẹo. Trong nuôi cấy, sự tăng sinh này có thể được duy trì nhiều hay ít là không hạn định, chỉ cần mô sẹo được cấy chuyển sang môi trường mới theo chu kỳ. Tuy nhiên, tế bào mô sẹo khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền. Để tránh tình trạng này nên sử dụng các loại mô sẹo vừa mới phát sinh. Nuôi cấy mô sẹo có vai trò vô cùng quan trọng trong công nghệ sinh học thực vật. Tỷ lệ auxin và cytokinin trong môi trường có thể dẫn tới sự phát triển của ngọn, rễ hay phôi soma; từ đó có thể tạo thành cây hoàn chỉnh. Nuôi cấy mô sẹo cũng có thể được sử dụng để mở đầu nuôi cấy tế bào dịch huyền phù, tạo ra hạt nhân tạo. 1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy 1.3.1. Ảnh hưởng của điều kiện khử trùng mẫu cấy Việc khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy là một ấn đề cần thiết, vì mẫu cấy ở trong tự nhiên tiếp xúc với môi trường xung quanh nên mang rất nhiều vi khuẩn, nấm… Nhưng, do mức độ nhiễm của mỗi loại mẫu là khác nhau
  16. 19. và đặc điểm của từng loại mẫu cũng khác nhau nên cần có sự thử nghiệm về khử trùng mẫu cấy nhằm thu được lượng mẫu vô trùng nhiều mà tốn ít nhiên liệu ban đầu. Khả năng tiêu diệt nấm và khuẩn của hóa chất khử trùng phụ thuộc vào nồng độ, thời gian xử lý và mức độ xâm nhập của chúng vào các ngõ ngách trên bề mặt của mô cấy. Thời gian khử trùng là một điều kiện quan trọng, nó phụ thuộc vào từng loại dung dịch khử trùng và đặc điểm của từng loại mẫu cấy. Với hypoclorite, người ta thường khử trùng trong thời gian 15-30 phút, HgCl2 thường có thời gian ít hơn. Thời gian quá lâu, dung dịch khử trùng xâm nhập vào mẫu có thể gây chết mẫu, thời gian quá ngắn sẽ không loại bỏ hết nấm và vi khuẩn nên mẫu dễ bị nhiễm. Sau khi khử trùng, mẫu cây được đặt vào các môi trường nuôi cấy, từ đây giai đoạn nuôi cấy in vitro bắt đầu. Thành phần của môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng quyết định tới nuôi cấy. 1.3. 2. Ảnh hưởng của các thành phần hóa học Trong nuôi cấy in vitro, cả yếu tố hóa học và yếu tố vật lý của cây trong các bình nuôi đều phải được cung cấp đầy đủ. Môi trường dinh dưỡng phải cung cấp tất cả các ion khoáng cần thiết, nguồn chất hữu cơ bổ sung như amino acid và vitamin, nguồn cacbon cố định, và một thành phần cần cho sự sống cũng phải được cung cấp đó là nước. Các nhân tố vật lý như nhiệt độ, pH, môi trường khí, ánh sáng và áp lực thẩm thấu, cũng phải được duy trì trong giới hạn chấp nhận. Hiện nay trên thế giới có rất nhiều môi trường được sử dụng như môi trường Murashige và Skoog (1962), môi trường Gamborg (1968), môi trường Knop (1974), môi trường Anderson, Went, Knudson, Lindemann…Trong đó môi trường MS được đánh giá là phù hợp rộng rãi nhất với nhiều loại cây trồng, bao gồm cả cây hai lá mầm và cây một lá mầm. Thông thường trong một môi trường nuôi cấy phải đảm bảo các thành phần hóa học sau: Các nguyên tố khoáng Tùy theo nồng độ sử dụng, các nguyên tố khoáng được chia vào hai nhóm là nguyên tố đa lượng và nguyên tố vi lượng. * Nguyên tố đa lượng: Các nguyên tố này thường chiếm 0,1 % khối lượng khô của thực vật. Nitơ, phốt pho, kali, magiê, canxi, và lưu huỳnh là các muối
  17. 20. vô cơ. Chúng có mặt trong các hợp chất quan trọng (diệp lục. protein, acid nucleic, acid amin…), tham gia vào các quá trình như điều chỉnh áp suất thẩm thấu tế bào, vận chuyển năng lượng trong hô hấp, quang hợp, thực hiện vai trò tín hiệu tế bào,… * Nguyên tố vi lượng: Được cung cấp với lượng rất thấp cho thực vật sinh trưởng, phát triển và có nhiều vai trò khác nhau. Mangan, iốt, đồng, coban, bo, mo, sắt và kẽm là các nguyên tố vi lượng, ngoài ra niken và nhôm cũng được tìm thấy trong một số công thức. Nguyên tố vi lượng thường có mặt trong thành phần của một số coenzyme, vitamin; tham gia vào các phản ứng trao đổi điện tử, sinh tổng hợp diệp lục,… Chất hữu cơ bổ sung * Các vitamin là những chất hữu cơ tham gia vào cấu trúc enzyme và cofactor trong nhiều phản ứng sinh hóa (Vũ Văn Vụ, 2006). Các loại vitamin B1, B6, PP và myoinositol là cần thiết cho nuôi cấy tế bào thực vật in vitro. Tuy nhiên, vì lý do lịch sử các loại vitamin khác nhau cũng được thêm vào để nuôi cấy. * Các amino acid có vai trò quan trọng trong việc phát sinh hình thái, amino acid, aLanine, glutamic acid, glutamine và proline cũng được sử dụng nhưng trong nhiều trường hợp là không cần thiết. Nguồn cacbon Các mô và tế bào thực vật nuôi cấy nói chung, không thể tự quang hợp hoặc quang hợp yếu do thiếu clorophin và các điều kiện khác…do đó phải bổ sung thêm cacbon. Saccharose thường được sử dụng làm nguồn cacbon do đó những đặc tính như rẻ, dễ kiếm, đồng hóa triệt để và tương đối ổn định. Ngoài ra, các loại đường khác như glucose, maltose, galactose và sorbitol cũng có thể được sử dụng và trong những trường hợp đặc biệt có thể cung cấp tốt hơn đường saccharose. Đường vừa là nguồn cacbon cung cấp cho mẫu nuôi cấy, đồng thời còn tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu của môi trường. Đường đóng góp khoảng 50-70 % vào khả năng thẩm thấu của môi trường (Trigiano and Gray, 2000). Thông thường đường saccharose được sử dụng ở nồng độ 0,2-0,3 %, nhưng nồng độ này có sự thay đổi ở từng đối tượng khác nhau và mục đích nuôi cấy khác nhau, có khi xuống tới 0,2 % (tạo dòng), có khi tăng lên đến 12 % (gây cảm ứng stress nước).
  18. 21. Sự hình thành rễ đòi hỏi một lượng đường được cung cấp từ quang hợp hoặc ngoại sinh. Theo George (1993) hầu hết các loại thực vật khi ra rễ thích hợp với lượng đường 20-30 g/lít. Tuy nhiên, cũng có loài yêu cầu nguồn carbohydrate ngoại sinh cao hơn. Ví dụ theo Sharma (1993) cây Gentiana kurroo chỉ có thể ra rễ tốt khi bổ sung 60 g/lít saccharose trong môi trường. Thí nghiệm áp dụng phương pháp quang tự dưỡng cho thấy các cây in vitro đã phát triển tốt trên môi trường không có đường và vitamin, độ thoáng khí cao. Tỷ lệ nhiễm nấm giảm đáng kể. Cây có diện tích lá lớn hơn và sự đóng mở của lá theo quy luật tự nhiên ngay khi gặp điều kiện thay đổi của môi trường. Trong khi đó cây nuôi cấy theo điều kiện truyền thống (có đường và vitamin) có diện tích lá nhỏ, khí khổng luôn luôn ở trạng thái mở trong nhiều giờ khi chuyển từ điều kiện in vitro ra vườn ươm. Tỷ lệ sống 95-100 % sau một tháng ở vườn ươm đối với cây nuôi cấy trên môi trường không có đường, trái lại chỉ từ 70-80 % theo phương pháp truyền thống (Nguyễn Thị Quỳnh và cộng sự, 2005). Chất điều tiết sinh trưởng Chất điều tiết sinh trưởng thực vật là thành phần môi trường khắt khe trong việc xác định con đường phát triển của tế bào thực vật. Các chất điều tiết sinh trưởng được sử dụng thông thường là các hormome thực vật hoặc các chất tổng hợp tương tự chúng, phổ biến là auxin và cytokinin, gibberellins, abscisic acid, ethylene. Trong đó auxin và cytokinin là hai nhóm được sử dụng phổ biến nhất. * Nhóm auxin gồm một số hợp chất có chứa nhân idol trong phân tử. Trong nuôi cấy in vitro, auxin thúc đẩy sinh trưởng của mẫu do hoạt hóa sự phân chia và giãn nở của tế bào, kích thích các quá trình tổng hợp và trao đổi chất, tham gia điều chỉnh sự phân hóa của rễ, chồi…(Bhojwani and Razdan, 1983). Các auxin được sử dụng với nồng độ thấp từ 10-6 – 10-1 M tùy theo từng chất, mục đích và đối tượng nghiên cứu. Hàm lượng auxin thấp sẽ kích thích sự phân hóa rễ, hàm lượng cao kích thích hình thành mô sẹo. Auxin được chia thành hai nhóm có nguồn gốc khác nhau: trong các auxin tự nhiên, quan trọng nhất là IAA. Nhưng IAA chỉ được dùng trong một số môi trường nuôi cấy do có đặc tính không ổn định với nhiệt độ và ánh sáng. Vì vậy, các amino acid kết hợp với IAA ổn định hơn được sử dụng phổ biến hơn làm
  19. 22. giảm bớt liên kết khi sử dụng IAA. Nhóm auxin tổng hợp tương tự IAA được sử dụng rộng rãi hơn trong các môi trường nuôi cấy như 2,4-D, IBA. NAA. * Cytokinin kích thích sự phân chia và ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của tế bào, cảm ứng hình thành chồi phụ và loại bỏ ưu thế ngọn (Nguyễn Như Khanh, 2002). Trong nuôi cấy mô thực vật cytokinin được dùng để kích thích sự phát sinh chồi, sử dụng kết hợp với auxin kích thích phân chia tế bào. Nồng độ cytokinin cao kìm hãm sự hình thành và phát triển của rễ (Narayaswamy, 1994). Trong các cytokinin tự nhiên có hai nhóm được sử dụng trong môi trường nuôi cấy, đó là zeatin và 2iP (2-isopentyl adenine). Nhưng chúng không được dùng phổ biến vì rất đắt (đặc biệt là zeatin) và không ổn định. Các chất tổng hợp tương tự như kinetin và BAP được sử dụng phổ biến hơn. Các chất hóa học không có based purin và thay thế bằng phenylureas, cũng được sử dụng như cytokinin trong môi trường nuôi cấy tế bào thực vật. Trong cây có sự cân bằng nội hoocmone (Vũ Văn Vụ, 2007). Do vậy, khi sử dụng các chất điều tiết sinh trưởng trong nuôi cấy cần đặc biệt lưu ý để sử dụng nồng độ thích hợp đạt hiệu quả cao. Nhiều tác giả đã tổng kết, tỷ lệ auxin/cytokinin nếu nghiêng về phía auxin sẽ kích thích hình thành rễ; nghiêng về phía cytokinin sẽ thúc đẩy hình thành chồi; ở tỷ lệ trung gian sẽ hình thành mô sẹo. Than hoạt tính Than hoạt tính ban đẫu được bỏ sung vào môi trường nuôi cấy để cố gắng mô phỏng điều kiện trồng trọt, sau đó nó được sử dụng rộng rãi trong nhiều môi trường nuôi cấy. Nhiều nghiên cứu cho thấy tác dụng của than hoạt tính trong môi trường nuôi cấy mô thực vật. Đó là: sự hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol, các sản phẩm trao đổi thứ cấp, ảnh hưởng tới pH, xúc tác bẻ gãy đường saccharose trong khử trùng (S.C. Van Winkle et al, 1995). Ngoài ra than cũng hút các chất hữu cơ như phytohormone, vitamin, sắt, kẽm, … (Nissen & Sutter, 1990). Điều tra tác dụng của than hoạt tính, sự khử trùng, và môi trường nuôi cấy trong thủy phân đường cho thấy, sự thủy phân của đường trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào cả ion H+ và sự khử trùng và thành phần than hoạt tính. Sau khử trùng, ở môi trường MS + 5 % saccharose bổ sung than hoạt tính cho tỷ lệ đường thủy phân là 70 %, tỷ lệ tương ứng ở môi trường Gamborg là 56 %, còn ở môi trường không có than hoạt tính là 20 % (Pan and Staden, 1999).
  20. 24. phòng nuôi cấy người ta sử dụng ánh sáng huỳnh quang chiếu sáng 14-15 giờ/ ngày với cường độ 2000 lux. Nhiệt độ Nhiệt độ trong phòng nuôi cấy mô thường được điều chỉnh ổn định từ 220 C đến 250 C. Tuy nhiên tùy từng loại nuôi cấy và đối tượng nuôi cấy mà có sự điều chỉnh nhiệt độ phù hợp. Theo nhiều nghiên cứu trong nuôi cấy mô sẹo, huyền phù tế bào với mục đích sản xuất các hợp chất thứ sinh thì sự điều chỉnh nhiệt độ rất có ý nghĩa, cảm ứng cho tế bào sinh trưởng, phân chia và tiết các hợp chất thứ sinh. Nhiệt độ còn ảnh hưởng tới nuôi cấy thông qua tác đông tới cấu trúc của các chất điều hòa sinh trưởng như IAA, GA3,… pH môi trường pH của môi trường cũng là một yếu tố rất quan trọng, ảnh hưởng tới trạng thái lý hóa của các chất trong môi trường, do đó ảnh hưởng tới khả năng điện ly của các muối, sự thủy phân hóa các chất… Thông thường pH được điều chỉnh ở mức 5,5 – 5,8. Trạng thái môi trường Sự phát triển của mô có thể bị thay đổi hoàn toàn nếu chúng nuôi cấy trên một môi trường đặc, lỏng hoặc nửa lỏng. Các mô nuôi cấy thường sinh trưởng tốt hơn trong môi trường lỏng, tuy nhiên môi trường lỏng cũng gây ra hiện tượng thủy tinh hóa, các mô nuôi cấy bị mọng nước gây khó khăn cho cấy chuyển và ra cây. 1.3.4. Ảnh hưởng của điều kiện ra cây Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình sản xuất một cây giống in vitro. Mục đích của giai đoạn này nhằm đưa cây giống in vitro trong phòng nuôi ra ngoài tự nhiên; huấn luyện cây thích nghi với các điều kiện nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng tự nhiên và chuyển từ chế độ dị dưỡng sang chế độ tự dưỡng. Mỗi loài cây có đặc điểm khác nhau, do đó để đạt tỷ lệ cây sống cao cần nghiên cứu để tìm giá thể phù hợp cho cây. Giá thể trồng cây có thể là cát, đất mùn hoặc các hỗn hợp nhân tạo không chứa đất, mùn cưa và bọt biển… Cây nuôi cấy in vitro có đặc điểm là các khí khổng luôn mở. Vì vậy, khi chuyển cây ra vườn ươm, cây thường bị mất nước rất nhanh, do đó cần phải che phủ cẩn thận và cung cấp đủ độ ẩm cho cây bằng cách phun sương. Cần cung
  21. 25. cấp cho cây lượng nước vừa đủ, lượng nước quá ít hoặc quá nhiều đều có ảnh hưởng không tốt cho cây. Ngoài ra, ở giai đoạn đầu đưa ra ngoài vườn ươm, bộ rễ của cây nuôi cấy in vitro thường chưa có khả năng hấp thụ các chất ding dưỡng từ giá thể. Để tăng chất lượng của cây giống, có thể sử dụng các dung dịch dinh dưỡng để tưới cho cây. 1.4. Quy trình sản xuất cây cấy mô Theo Debergh (1991) thì quy trình nhân giống được chia làm 5 giai đoạn: a) Lấy mẫu và xử lý mẫu Đây là giai đoạn đầu tiên trong quy trình, cần đặc biệt chú ý vì những đặc tính của mẫu cấy sẽ được duy trì và nhân lên ở tất cả các cây giống sau này. Cần chọn lọc cây mẹ ưu việt, khỏe, có giá trị kinh tế cao; trên cây mẹ tiến hành chọn cơ quan, mô để lấy mẫu, thường là chồi non, đoạn thân có chồi ngủ, hoa non, lá non… Khả năng nhiễm bệnh của mẫu phụ thuộc vào cách lấy mẫu, xử lý mẫu và điều kiện khử trùng. Mỗi loài cây có ngưỡng nhiệt độ và độ ẩm phù hợp khi bảo quản và xử lý mẫu. Với các cây cận nhiệt đới và nhiệt đới thì nhiệt độ 250 C, độ ẩm 75 % là điều kiện giữ mẫu thích hợp, tỷ lệ nhiễm bệnh thấp (Deborgh and Zimmerman, 1991). b) Tái sinh mẫu nuôi cấy Mục đích của giai đoạn này là tái sinh các cơ quan từ mẫu nuôi cấy. Khả năng thành công của nuôi cấy mô tế bào thực vật phụ thuộc vào trạng thái tuổi của tế bào mẫu nuôi cấy, càng gần trạng thái phôi sinh thì khả năng tái sinh càng lớn. Sau một thời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào hoặc cơ quan (chồi, cụm chồi, rễ) hoặc các phôi vô tính có đặc tính gần như phôi hữu tính. c) Nhân nhanh chồi Cần tạo ra tốc độ nhân nhanh cao nhất trong điều kiện nuôi cấy, vì vậy thành phần và điều kiện môi trường phải được tối ưu nhằm đạt được mục tiêu nhân nhanh. Môi trường ở giai đoạn này cần bổ sung các hormone sinh trưởng (cytokinin, auxin), tăng thời gian chiếu sáng lên từ 16 giờ/ ngày, cường độ ánh sáng tối thiểu là 1000 lux, nhiệt độ thích hợp là từ 20 – 300 C. Quy trình cấy chuyển nhân nhanh chồi thông thường diễn ra trong khoảng
  22. 26. 1-2 tháng tùy từng loại cây. Tỷ lệ nhân nhanh sau mỗi lần cấy chuyển đạt khoảng 2 – 8 lần/ 1 lần cấy chuyển. Giai đoạn nhân nhanh chồi từ một vài chồi ban đầu không nên kéo dài quá lâu để tránh biến dị soma. Ví dụ từ một chồi cây chuối chọn lọc ban đầu người ta chỉ nên nhân lên khoảng 2000 – 3000 chồi cây sau 7 – 8 lần cấy chuyển, đối với các cây khác như mía, cúc, hoa phong Lan sau một năm có thể nhân được trên 1 triệu chồi từ một cây mẹ ban đầu. d) Tái sinh rễ Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát rễ tự sinh, nhưng thông thường các chồi này phải được cấy chuyển sang một môi trường khác để kích thích tạo rễ. Môi trường tái sinh rễ thường được bổ sung auxin (NAA, IBA, 2,4-D) ở liều lượng thích hợp. Tuy nhiên, một số cây như chuối thì sự hình thành rễ tốt hơn ở môi trường không có chất sinh trưởng. e) Chuyển cây ra vườn ươm Các cây nuôi cấy in vitro sau khi đã tái sinh hoàn chỉnh sẽ được chuyển ra ngoài vườn ươm. Cây chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng. Vì vậy, cần huấn luyện cho cây thích nghi với sự thay đổi của môi trường. 1.5. Tình hình nghiên cứu cây lan Kim tuyến 1.5.1.Tình hình nghiên cứu trên thế giới Chi lan Kim tuyến (Anoectochilus) đã được nghiên cứu chủ yếu ở Trung Quốc một cách toàn diện cả về đặc điểm hình thái, kỹ thuật nhân giống, khả năng trồng, thành phần hóa học và công dụng phòng, chữa bệnh (Lai Wan Yu, Lai Wan Nian, 2005). Chow và CS (1982) đã nghiên cứu về nguồn vật liệu sử dụng cho nhân sinh khối in vitro loài Anoectochilus formosanus rất đa dạng. Năm 1987, Liu và CS đã chọn chồi đỉnh để nuôi cấy mô. Cũng năm 1987, Ho và CS, năm 1992, Lee và CS đã sử dụng phôi hạt để làm nguồn vật liệu nuôi cấy. Năm 2001, các tác giả Yih-juh Shiau, Abhay Psagare, Uei-Chin Chen, Shu-Ru Yang và Hsin-Sheng Tsay đã nghiên cứu thành công loài Lan Kim tuyến (Anoectochilus formosanus Hayata) từ hạt với công thức môi trường vào mẫu là: 1/2MS + 0,2% than hoạt tính + 8% dịch chiết chuối. Môi trường được sử dụng để nhân nhanh chồi là: 1/2MS + 0,2% than hoạt tính + 8% dịch chiết chuối + 2mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA.
  23. 27. Năm 2002, Tsay và CS đã cắt các mắt đốt thân lấy từ cây Anoectochilus Formosanus Hayata 2 năm tuổi cấy vào môi trường MS lỏng dung tích 500 ml + 2mg/l BAP + 0,5mg/l NAA + 2% than hoạt tính. 1.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước Hiện nay, lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) được xếp trong nhóm IA trong sách đỏ Việt Nam, cần bảo tồn các quần thể nhỏ còn sót lại ở các Vườn Quốc gia và Khu Bảo tồn thiên nhiên, cũng như cần nghiên cứu nhân giống tạo hàng hóa xuất khẩu và bảo vệ nguồn gen. Ở Việt Nam do bị người dân thu hái tự phát để bán làm thuốc nên loài lan Kim tuyến đang bị đe dọa nghiêm trọng, rất có thể sẽ bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên nếu chúng ta không có biện pháp bảo tồn hữu hiệu. Mặc dù vậy cho đến nay, ở nước ta vẫn chưa có bất kì công trình nghiên cứu nào về kỹ thuật nhân giống, gây trồng cho loài cây quý này được công bố. Do vậy, có thể nói việc nghiên cứu nhân nhanh loài lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume bằng phương pháp nhân giống in vitro vừa có ý nghĩa lý luận và ý nghĩa về mặt thực tiễn. Những năm gần đây, đã có một số đề tài nghiên cứu về đặc điểm hình thái, phân bố và kỹ thuật nhân giống in vitro loài lan Kim tuyến này như: Năm 2004, Nguyễn Văn Kiệt cũng đã đưa ra quy trình nhân giống in vitro thành công cho loài lan Kim tuyến Anoectochilus formosanus với vật liệu ban đầu là từ chồi đỉnh tại đại học Chungbuk, Hàn Quốc. Môi trường tạo vật liệu khởi đầu là H3 (Hyponex: 6,5N-4,5P-19K 1g/l + 20N-20P-20K 1g/l) + 2g/l peptone. Môi trường nhân nhanh là: H3 + 1mg/l BAP (hoặc 1-2mg/l TDZ) + 1% than hoạt tính. Năm 2010, Phùng Văn Phê, Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nguyễn Trung Thành. Đã đạt được những kết quả bước đầu trong nhân nhanh chồi in vitro loài Lan kim tuyến – Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl. Nă m 2010,Phan Ngọc Khoa, Trường Đại học Khoa học Huế đã nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến nhân giống in vitro lan Kim tuyến.”. Các tác giả trên đã bước đầu tiến hành thăm dò ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng và bước đầu tiến hành nhân giống thử nghiệm lan Kim tuyến nhưng chưa tác giả nào đưa ra quy trình hoàn chỉnh để nhân giống loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume). Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi đặc biệt chú trọng đến nghiên cứu nhân nhanh và quy trình ra cây hoàn chỉnh cho loài thảo dược quý hiếm này.
  24. 28. CHƯƠNG II. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Cây lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) Hình 2.1. Cây Lan Kim tuyến ngoài tự nhiên Mẫu chồi được tái sinh từ thân ngầm, thân khí sinh của cây lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) được thu từ Vườn quốc gia Tam Đảo, Vĩnh Phúc. 2.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu + Địa điểm: Thí nghiệm được tiến hành tại Viện Sinh học Nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội và Phòng công nghệ tế bào Thực vật, Trung tâm Nghiên cứu Khoa học Sự sống, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên. + Thời gian: từ tháng 11/2011 – 12/2012 2.2. Mục tiêu nghiên cứu – Xác định điều kiện khử trùng mẫu nuôi cấy thích hợp, tìm ra các môi trường thích hợp cho việc nhân nhanh in vitro. – Xác định điều kiện ra cây và bước đầu đưa cây ra vườn ươm.
  25. 29. 2.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2.3.1. Ý nghĩa khoa học – Đề tài sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học về loài lan (Anoectochilus setaceus Blume), chi Lan Kim tuyến. – Cung cấp những cơ sở khoa học về quy trình nhân giống in vitro lan Anoectochilus setaceus Blume. – Các kết quả nghiên cứu sẽ bổ sung thêm tài liệu khoa học phục vụ cho công tác giảng dạy, nghiên cứu khoa học về loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume). 2.3.2. Ý nghĩa thực tiễn – Đề xuất được quy trình nhân giống in vitro cho lan Anoectochilus setaceus Blume. – Góp phần bảo tồn, thúc đẩy sản xuất cây Anoectochilus setaceu Blume như một nghề trồng lan mang lại giá trị kinh tế cao. 2.4. Nội dung nghiên cứu 2.4.1. Nghiên cứu xác định chất khử trùng, thời gian khử trùng và cơ quan vào mẫu thích hợp. 2.4.2. Nghiên cứu xác định môi trường khởi động và nhân nhanh thích hợp. + Xác định môi trường nền thích hợp. + Nghiên cứu ảnh hưởng của các nhóm chất điều tiết sinh trưởng đến sự phát sinh hình thành và hệ số nhân. 2.4.3. Nghiên cứu môi trường thích hợp cho sự ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh. 2.4.4. Nghiên cứu điều kiện ra cây thích hợp cho loài lan Kim tuyến (Anoectochilus Setaceus Blume). 2.5. Phương pháp nghiên cứu Điều kiện nuôi cấy – Mẫu được cấy trên môi trường đã được khử trùng ở 1,4 atm, 1210 C
  26. 30. – pH của môi trường là: 5,4. – Nhiệt độ phòng nuôi: 25±20 C – Cường độ ánh sáng: 2000 lux – Thời gian chiếu sáng: 16 giờ chiếu sáng/ngày đêm 2.5.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm A. Xác định các phương pháp khử trùng tạo mẫu sạch Thí nghiệm 1. Xác định chất khử trùng thích hợp Chồi và mắt đốt ngang thân cây lan Kim tuyến sau thu hái, được rửa sạch bằng xà phòng, sau đó được thử nghiệm khử trùng bằng cồn 70o và H2O2 0,01% trong các khoảng thời gian khác nhau. Sau đó được rửa sạch lại nhiều lần bằng nước cất vô trùng rồi cấy vào môi trường vào mẫu là: 1/2MS + 0.2% than hoạt tính + 0,8% dịch chiết chuối. Thí nghiệm được tiến hành với các công thức khử trùng: CT1: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s. CT2: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 20s. CT3: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 30s. CT4: Ngâm trong NaClO 2% trong 5 phút (300s). CT5: Ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút (600s). CT6: Ngâm trong NaClO 2% trong 15 phút (900s). CT7: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s rồi ngâm trong NaClO 2% trong 5 phút. CT8: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s rồi ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút. CT9: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s rồi ngâm trong NaClO 2% trong 15 phút. Thí nghiệm 2. Xác định cơ quan vào mẫu thích hợp nhất cho việc tạo mẫu sạch Các cơ quan khác nhau là: Chồi đỉnh, chồi nách, mắt đốt ngang thân được
  27. 31. khử trùng bằng công thức khử trùng hiệu quả nhất (rút ra ở Thí nghiệm 1). Theo dõi số mẫu sống, số mẫu bị nhiễm. Thí nghiệm 3. Xác định cơ quan vào mẫu thích hợp đến hệ số nhân chồi in vitro Cấy mẫu vào môi trường nhân cơ bản là MS + 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin + 100 ml/l ND + 100 g/l dịch chiết khoai tây + 20 g/l sucrose + 7 g/l agar. Mỗi loại vật liệu (chồi đỉnh, chồi nách, mắt đốt ngang thân) được bố trí 3 lần lặp lại, mỗi lần 7 mẫu. B. Xác định môi trường khởi động và nhân nhanh thích hợp Khi các mẫu sạch bệnh được chuyển sang môi trường nhân nhanh. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện nuôi trồng khác nhau đối với quá trình nhân nhanh. Mỗi công thức được bố trí 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 7 mẫu, mỗi công thức là 21 mẫu. Thí nghiệm 4. Xác định môi trường nền thích hợp cho nuôi cấy mô cây Lan Kim tuyến (A. setaceus) Thí nghiệm được tiến hành dựa trên ba môi trường nền được sử dụng phổ biến hiện nay là MS, Knudson C và Knudson C cải tiến (Knud*). Các công thức được tiến hành trên nền môi trường chung là: Nền môi trường = 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar. CT1: Knud* + Nền môi trường CT2: MS + Nền môi trường CT3: Knudson C + Nền môi trường Thí nghiệm 5. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất cytokinin (BAP và kinetin) đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân Sau khi tìm ra môi trường nền thích hợp trong thí nghiệm 4, thí nghiệm 5 tiếp tục tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất cytokinin tới khả năng phát sinh chồi lan Kim tuyến. Trong đó, môi trường nền sử dụng chung cho các
  28. 32. công thức là: Nền môi trường = Môi trường nền (TNo4) + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar. CT1: ĐC CT2: Nền môi trường + 0,1mg/l BAP CT3: Nền môi trường + 0,5mg/l BAP CT4: Nền môi trường + 1,0 mg/l BAP CT5: Nền môi trường + 2,0 mg/l BAP CT6: Nền môi trường + 0,1mg/l Kinetin CT7: Nền môi trường + 0,5mg/l Kinetin CT8: Nền môi trường + 1,0 mg/l Kinetin CT9: Nền môi trường + 2,0 mg/l Kinetin Thí nghiệm 6. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất Auxin (IBA và α-NAA) đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân Thí nghiệm tiếp tục được tiến hành trên nền môi trường trên và thăm dò ảnh hưởng của auxin với các nồng độ khác nhau Nền môi trường = Môi trường nền (TNo4) + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar. CT1: ĐC CT2: Nền môi trường +0,5 mg/l IBA CT3: Nền môi trường +1,0 mg/l IBA CT4: Nền môi trường +1,5 mg/l IBA CT5: Nền môi trường +2,0 mg/l IBA CT6: Nền môi trường +3,0 mg/l IBA CT7: Nền môi trường +0,5 mg/l α-NAA CT8: Nền môi trường +1,0 mg/l α-NAA CT9: Nền môi trường +1,5 mg/l α-NAA CT10: Nền môi trường +2,0 mg/l α-NAA
  29. 33. CT11: Nền môi trường +3,0 mg/l α-NAA Thí nghiệm 7. Nghiên cứu ảnh hưởng của sự phối hợp 2 nhóm chất là cytokinin và auxin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân Qua các kết quả thực nghiệm cho thấy, nồng độ BAP và Kinetin khi sử dụng phối hợp là 0,5mg/l và 0,3mg/l do đó thí nghiệm sẽ tiếp tục thăm dò ảnh hưởng của sự phối hợp 2 nhóm chất trên dựa trên nền môi trường: Nền môi trường = Môi trường nền (TNo4) + 0,5mg/l BAP + 0,3mg/l Kinetin + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar. CT1: Nền môi trường +0,1mg/l IBA CT2: Nền môi trường +0,3mg/l IBA CT3: Nền môi trường +0,5mg/l IBA CT4: Nền môi trường + 0,1mg/l α-NAA CT 5: Nền môi trường +0,3mg/l α-NAA CT6: Nền môi trường +0,5mg/l α-NAA C. Nghiên cứu ra rễ tạo cây hoàn chỉnh Khi các chồi lan Kim tuyến có chiều cao 3-4 cm, có 3-4 lá được cấy chuyển sang môi trường ra rễ. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền (không có chất điều tiết sinh trưởng) và than hoạt tính đến sự ra rễ. Mỗi công thức được bố trí 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 6 mẫu, mỗi công thức là 18 mẫu. Thí nghiệm 8. Ảnh hưởng của môi trường nền (môi trường dinh dưỡng cơ bản) đến sự ra rễ CT1: MS + 20g/l Sucrose + 7g/l agar CT2: MS/2 + 20g/l Sucrose + 7g/l agar CT3: Knud* + 20g/l Sucrose + 7g/l agar CT4: Knud*/2 + 20g/l Sucrose + 7g/l agar Thí nghiệm 9. Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến sự ra rễ Các thí nghiệm được tiến hàn trên nền môi trường nghèo dinh dưỡng
  30. 34. CT1= ĐC= Nền = MS + 20g/l Sucrose + 0% than hoạt tính + 7g/l agar CT2: Nền + 1% than hoạt tính CT3: Nền + 3% than hoạt tính CT4: Nền + 5% than hoạt tính D. Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện chăm sóc tới khả năng sinh trưởng của loài lan Kim tuyến (Anoectochilus Setaceus Blume) in vitro ngoài vườn ươm. Cây cao 3-4cm, mọc 3-4 lá và có 3-4 rễ đủ tiêu chuẩn đưa ra ngoài vườn ươm. Cây in vitro cho ra khỏi môi trường tạo rễ, rửa sạch agar bám trên rễ, rồi trồng trong giá thể ngoài vườn ươm. * Cách bố trí thí nghiệm: – Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, mỗi công thức lặp lại 3 lần, mỗi chậu trồng 3 cây. – Định kì theo dõi: 7 ngày/1lần, chúng tôi đo chiều cao cây, đến rễ lá, số nhánh trong mỗi lần đo định kì. – Số cây theo dõi – Cách tưới: Phun mù dưới dạng sương mù vào lúc sáng sớm Thí nghiệm 10. Nghiên cứu giá thể phù hợp cho việc ra cây loài Lan Kim tuyến (Anoectochilus Setaceus Blume) in vitro Giá thể: CT 1: Giá thể 100% dớn CT 2: Giá thể 50% Dớn + 50% xơ dừa CT 3: Giá thể 100% xơ dừa CT 4: Giá thể 100% bột dừa Thí nghiệm 11. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian huấn luyện cây trong bình đến tỷ lệ sống của lan Kim tuyến khi trồng lên giá thể Thí nghiệm được bố trí với thời gian huấn luyện cây khác nhau: ĐC: 0 ngày CT1: 4 ngày CT2: 8 Ngày
  31. 35. CT3: 12 Ngày CT4: 16 ngày Cây sau khi huấn luyện sẽ được trồng vào giá thể là dớn và xơ dữa trộn lẫn trong nhà lưới được che kín bằng lưới đen. Thí nghiệm 12. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian che phủ ở nhà lưới đến tỷ lệ sống của lan Kim tuyến khi trồng lên giá thể Cây Lan in vitro sau khi huấn luyện, đủ tiêu chuẩn đem ra trồng, sẽ được rửa sạch thạch và trồng lên giá thể ở nhà lưới. Luống cây sau khi trồng sẽ được che kín bằng nilon trắng, phía trên che bằng lưới đen có độ che sáng 50%. Thí nghiệm được bố trí với các khoảng thời gian che kín nilon khác nhau: ĐC: 0 ngày CT1: 5 ngày CT2: 10 Ngày CT3: 15 Ngày 2.5.2. Phương pháp đánh giá kết quả và xử lý số liệu Các chỉ tiêu theo dõi Σ Số mẫu nhiễm 1. Tỷ lệ nhiễm (%) = x 100 Σ Số mẫu theo dõi Σ Số mẫu sống 2. Tỷ lệ mẫu sống ( %) = x 100 Σ Số mẫu theo dõi Σ Số mẫu tạo chồi 3. Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) = x 100 Σ Số mẫu cấy ban đầu
  32. 36. Σ Số mẫu thu được 4. Hệ số nhân (lần) = Σ Số mẫu cấy ban đầu Σ Chiều cao các chồi 5. Chiều cao TB chồi (cm) = Σ Chồi theo dõi Σ Số chồi thu được 6. Số chồi (chồi/mẫu) = Σ Số mẫu ban đầu Σ Số đốt 7. Số đốt (đốt/chồi) = Σ Số chồi Σ Số lá 8. Số lá (lá/chồi) = Σ Số chồi Σ Số mẫu tạo rễ 9. Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%) = x 100 Σ Số mẫu theo dõi Σ Số rễ 10. Số rễ (rễ/chồi) = Σ Số chồi
  33. 37. Σ Chiều dài rễ 11. Chiều dài TB rễ (cm) = Σ Số rễ Phương pháp xử lý số liệu Số liệu được xử lý theo chương trình MICROSOFT EXCEL và IRRISTART 5.0 trên máy vi tính. 12. Chỉ tiêu thu thập: Tỷ lệ sống của cây con, đặc điểm của cây con Số cây sống Tỷ lệ sống của cây con = x 100 Tổng số cây trồng ban đầu Đặc điểm của cây con (màu sắc lá, hình thái lá và rễ). 13. Thời gian thu thập: cứ 1 tuần quan sát và ghi số liệu 1 lần.
  34. 38. CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu sạch và xác định cơ quan vào mẫu phù hợp cho việc nhân nhanh in vitro Nhân giống in vitro có hệ số nhân giống cao, cây con tạo ra đồng nhất và sạch bệnh. Muốn vậy, trong bất kỳ quy trình nhân giống nào thì việc chọn vật liệu khởi đầu và việc tạo mẫu sạch in vitro chính là điều kiện tiên quyết để quyết định thành công của toàn bộ quá trình. Bởi vì đây chính là giai đoạn cung cấp nguồn mẫu sạch cho các giai đoạn tiếp theo của quá trình nhân giống. Mẫu sạch in vitro được tạo ra từ nhiều nguồn, có thể là từ các bộ phận sinh dưỡng (thân, lá, rễ, phát hoa…) hoặc từ cơ quan sinh sản (quả). Trong nghiên cứu này các loại vật liệu đã sử dụng là thân khí sinh, thân ngầm được cắt đoạn và cho vào mẫu để lựa chọn loại mẫu cấy phù hợp. 3.1.1. Xác định chất khử trùng thích hợp Khử trùng mẫu là khâu quan trọng nhằm loại bỏ các nguồn nấm, vi khuẩn, virus khỏi mẫu, thu được nguồn mẫu vô trùng cho các nghiên cứu tiếp theo. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới kết quả khử trùng như phương pháp lấy mẫu, thời điểm lấy mẫu, thời gian khử trùng, hóa chất khử trùng… Trong thí nghiệm này hóa chất được sử dụng là cồn 70⁰ và NaClO 2% bố trí ở các khoảng thời gian khác nhau. Sau khi khử trùng mẫu được cấy vào môi trường vào mẫu, sau một khoảng thời gian nhất định, thường là từ sau 2-3 tuần những mẫu sạch bắt đầu tái sinh. Đánh giá khả năng tái sinh là bước tiếp theo để tìm ra công thức khử trùng tốt nhất. Kết quả thu được sau 15 ngày thể hiện ở Bảng 3.1.
  35. 39. Bảng 3.1. Ảnh hưở hiệu quả tạo mẫu sạch Công thức thí nghiệm Chất khử trùng CT1 Cồn 70⁰ (A)CT2 CT3 CT4 NaClO 2%CT5 CT6 CT7 Cồn 70⁰ (A) + NaClO 2% CT8 CT9 Hình 1. Ảnh hưởng của ch tạo mẫu sạch cây Qua bảng 3.1 và đồ th Với chất khử trùng là c 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00 90.00 100.00 CT1 CT2 CT3 ởng của chất khử trùng và thời gian khử ch cây lan Kim tuyến (kết quả theo dõi sau 15 ngày) trùng Thời gian khử trùng (s) Tỷ lệ mẫu sống (%) (A) 10 47,62 20 28,57 30 14,29 NaClO 2% (B) 300 42,86 600 57,14 900 33,33 (A) + NaClO 2% (B) 10A + 300B 71,43 10A + 600B 90,48 10A + 900B 61,90 a chất khử trùng và thời gian khử trùng đ ch cây lan Kim tuyến (kết quả theo dõi sau 15 ngày) thị 3.1 ta có nhận xét sau: trùng là cồn 70⁰ : CT4 CT5 CT6 CT7 CT8 CT9 Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) ử trùng đến theo dõi sau 15 ngày) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) 52,38 47,62 38,10 23,81 9,52 19,05 38,01 28,57 33,33 trùng đến hiệu quả theo dõi sau 15 ngày) Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)
  36. 40. Cồn 700 là chất có tác dụng sát khuẩn và phá hủy thành cellulozo của tế bào thực vật nên khi kéo dài thời gian khử trùng thì tỷ lệ sống của mẫu giảm đồng thời tỷ lệ nhiễm cũng giảm. Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, thời gian khử trùng với cồn 70⁰ trong 10s (CT1) cho tỷ lệ mẫu sống cao nhất (47,62%) do thời gian ngắn thành tế bào ít bị phá hủy là nhưng tỷ lệ nhiễm cũng cao (52,38%) do chưa đủ để dung dịch khử trùng giết chết các nguồn bệnh. Khi tăng thời gian khử trùng lên 20s (CT2) thì tỷ lệ sống và tỷ lệ nhiễm giảm là 28,57% và 47,62%. Tiếp tục tăng thời gian khử trùng lên 30s (CT3) thì tỷ lệ sống tiếp tục giảm còn 14,29% và 38,1%. Với chất khử trùng là NaClO 2% NaClO 2% là hóa chất có tính sát khuẩn cao nên khi tăng thời gian khử trùng thì tỷ lệ nhiễm sẽ giảm nhưng nếu thời gian khử trùng lâu thì dung dịch có thể xâm nhập vào bên trong gây độc với mẫu. Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, khi khử trùng trong thời gian 5 phút (CT4) thì tỷ lệ nhiếm cao (23,81%) do thời gian chưa đủ để diệt các nguồn bệnh. Khi tăng thời gian khử trùng lên 10 phút (CT5) thì tỷ lệ nhiễm thấp nhất (9,52%), tỷ lệ sống cao (57,14%). Tiếp tục tăng thời gian khử trùng lên tới 15 phút(CT6) dung dịch đã gây độc cho mẫu nên tỷ lệ sống thấp hơn (33,33%), tỷ lệ nhiễm tăng lên. Như vậy, thời gian khử trùng bằng NaClO 2% tốt nhất là trong 10 phút, cho tỷ lệ sống cao và tỷ lệ nhiễm thấp. Khử trùng bằng phương pháp kết hợp giữa cồn 70⁰ và NaClO 2% Khi kết hợp cả hai chất khử trùng trên với thời gian khử trùng thích hợp đã khắc phục được các nhược điểm của từng chất nên cho tỷ lệ sống cao hơn và tỷ lệ nhiễm giảm. Kết quả thí nghiệm cho thấy, phương pháp khử trùng là ngâm cồn 70⁰ trong 10s rồi ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút (CT8) cho tỷ lệ sống cao nhất đạt 90,48% và tỷ lệ nhiễm thấp (28,57%). Như vậy, thời gian khử trùng mẫu có ảnh hưởng khá lớn tới tỷ lệ sống của mẫu cấy. Công thức khử trùng CT8 (ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s rồi ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút) là vừa đủ, vừa có khả năng tiêu diệt mầm bệnh mà lại tác động nhẹ đến thành tế bào nên cho tỷ lệ sống cao và kích thích mẫu
  37. 41. tái sinh. 3.1.2. Xác định cơ quan vào mẫu thích hợp để tạo mẫu sạch và tăng hệ số nhân chồi in vitro Mục tiêu đặt ra của quy trình khử trùng cho bất kỳ loài cây nào đều là tạo được tỷ lệ mẫu sạch cao đồng thời có khả năng tái sinh mạnh. Một trong các yếu tố chính ảnh hưởng đến khả năng này là bản chất vật liệu làm mẫu cấy. Mẫu cấy tiếp xúc với nước, đất như rễ thường có lượng vi sinh vật rất cao và khó loại bỏ hoàn toàn chúng khỏi nguồn mẫu. Mẫu mọng nước, có lông thường khó khử trùng hơn những mẫu không mọng nước, bề mặt nhẵn. Trong nghiên cứu này các vật liệu được khử trùng được khử trùng theo công thức khử trùng tốt nhất suy ra từ kết quả nghiên cứu phần 3.1.1 3.1.2.1. Ảnh hưởng của loại vật liệu đến tỷ lệ tạo mẫu sạch Qua kết quả thí nghiệm 1 cho thấy, điều kiện khử trùng hiệu quả nhất đối với loài Lan Kim tuyến là: Ngâm trong cồn 70o trong 10s sau đó ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút. Do đó, để xác định cơ quan vào mẫu phù hợp nhất thí nghiệm tiếp tục áp dụng điều kiện khử trùng trên với các vật liệu khác nhau của cây lan Kim tuyến là: Chồi đỉnh, chồi nách, mắt đốt ngang thân. Kết quả thu được sau 15 ngày được thể hiện ở Bảng 3.2.
  38. 42. Bảng 3.2. Ảnh hưởng c Cơ quan vào mẫu Chồi đỉnh Chồi nách Mắt đốt ngang thân Hình 2. Ảnh hưởng c Theo kết quả ở bảng đốt ngang thân là vật liệu cho t nhất (16,67%), thứ hai là ch 33,33%, thấp nhất là chồi nách cho t Nguyên nhân của sự khác bi tuyến (Anoecctochilus setaceus số lượng lớn các mầm bệnh gây nhi khử trùng. 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00 Chồi đỉnh ng của loại vật liệu đến tỷ lệ tạo mẫu sạ thu được sau 15 ngày) Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ nhi 66,67 33,33 50,00 27,78 t ngang thân 72,22 16,67 ng của loại vật liệu đến tỷ lệ tạo mẫu sạch được sau 15 ngày) 3.2 và hình 2 cho thấy, khi khử trùng mẫ u cho tỷ lệ sống cao nhất (72,2%) và tỷ ai là chồi đỉnh cho tỷ lệ sống là 66,67% và t i nách cho tỷ lệ sống là 50% và tỷ lệ nhiễ khác biệt này là do đặc điểm thân khí sinh c setaceus) có rất nhiều lông tơ do vậy trên b nh gây nhiễm mẫu, do đó gặp khó khăn trong công tác Chồi nách Mắt đốt ngang thân Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ nhiễm (%) ạch (Kết quả nhiễm (%) 3,33 7,78 6,67 ch (Kết quả thu ẫu cấy thì mắt lệ nhiễm thấp ng là 66,67% và tỷ lệ nhiễm là ễm là 27,78%. m thân khí sinh của Lan Kim y trên bề mặt có một p khó khăn trong công tác Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ nhiễm (%)
  39. 43. Qua kết quả nghiên cứu ở thí nghiệm này cho thấy, cơ quan vào mẫu thích hợp cho việc tạo mẫu sạch là mắt đốt ngang thân. 3.1.2.2. Ảnh hưởng của cơ quan vào mẫu đến hệ số nhân chồi in vitro Cơ quan vào mẫu có ảnh hưởng rõ rệt đến hệ số nhân chồi. Ở một số loài, cơ quan vào mẫu có tỷ lệ mẫu sạch bệnh cao nhất nhưng lại cho hệ số nhân chồi thấp nhất. Do đó, để đạt hiệu quả nhân nhanh chồi in vitro loài lan Kim tuyến, chúng tôi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của cơ quan vào mẫu đến hệ số nhân chồi lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume). Kết quả thí nghiệm thu được thể hiện qua Bảng 3.3. Bảng 3.3. Ảnh hưởng của cơ quan vào mẫu đến hệ số nhân chồi in vitro (kết quả theo dõi sau 8 tuần). Cơ quan vào mẫu Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Hệ số nhân chồi (lần) Chiều cao TB chồi (cm) Chồi đỉnh 33,33 2,11 2,58 Chồi nách 50 3,50 2,97 Mắt đốt ngang thân 100 4,56 3,2 CV% 0 3,6 2,7 LSD0,05 0,01 0,25 0,16 Chồi đỉnh Chồi ngọn Mắt đốt ngang thân Hình 3. Ảnh hưởng của cơ quan vào mẫu đến hệ số nhân chồi Phân tích phương sai một nhân tố với 3 lần lặp của tỷ lệ mẫu sạch, hệ số nhân và chiều cao chồi đều được hiệu của trung bình mỗi công thức lớn hơn LSD0,05 chứng tỏ cơ quan vào mẫu có ảnh hưởng rõ rệt đến tỷ lệ tạo chồi, hệ số
  40. 44. nhân và chiều cao TB chồi ở độ tin cậy 95%. Qua kết quả ở Bảng 3.3 cho thấy, khi cấy các vật liệu là chồi đỉnh, chồi nách, mắt đốt ngang thân vào môi trường nhân nhanh phù hợp, kết quả theo dõi sau 8 tuần cho thấy mắt đốt ngang thân là cơ quan tái sinh và phát triển tốt nhất với tỷ lệ tạo mẫu là 100%, hệ số nhân 4,56 lần, chồi dài 3,2 cm. Cơ quan nhân kém nhất là chồi đỉnh với tỷ lệ tạo chồi chỉ đạt 33,33%, hệ số nhân là 2,11 lần và chiều dài chồi là 2,6 cm. Chồi nách cho tỷ lệ tạo mẫu là 44,44%, hệ số nhân 3,5 lần và chiều dài chồi 2,95 cm. Như vậy, cơ quan vào mẫu thích hợp nhất để tăng hệ số nhân chồi in vitro lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus) là mắt đốt ngang thân. 3.2. Nghiên cứu môi trường khởi động và nhân nhanh thích hợp Trong nuôi cấy in vitro, môi trường nuôi cấy đóng vai trò quan trọng. Vừa phải cung cấp chất dinh dưỡng cho mẫu vừa phải biệt hoá mẫu theo những hướng xác định. Do đó nghiên cứu lựa chọn môi trường nuôi cấy phù hợp nhất sẽ cho hệ số nhân cao, chất lượng chồi tốt. 3.2.1. Xác định môi trường nền thích hợp cho nuôi cấy mô Lan Kim tuyến (A. setaceus) Những nghiên cứu về nuôi cấy Phong lan in vitro cho thấy có một số môi trường thích hợp để nuôi cấy Phong lan như: MS; môi trường Knudson C cho Cattleya, Cymbidium (Adirti, 1993), môi trường Knudson cải tiến (Knud*), môi trường Hyponex (Lou and Kako,1995; Nakano et al, 2000…), môi trường Vaccin &Went… Trong đề tài này chúng tôi nghiên cứu nuôi cấy loài Lan Kim tuyến trên ba loại môi trường cơ bản: MS, Knudson C và Knud*. Thể chồi 4 tuần tuổi từ môi trường vào mẫu được cấy vào các môi trường khác nhau là MS, Knud*, Knudson có bổ sung thêm 20g/l sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar. Sau 8 tuần nuôi cấy ta thu được kết quả sau:
  41. 45. Bảng 3.4. Ảnh hưởng của môi trường nền đến khả năng nhân nhanh chồi, mắt đốt lan Kim tuyến Môi trường Số chồi (chồi/mẫu) Chiều cao TB chồi (cm) Số lá (lá/chồi) Đặc điểm thể chồi Knud* 3,67 3,57 4,12 Mập, xanh MS 2,11 1,33 1,55 Gầy, xanh nhạt Knudson C 2.06 2,22 2,35 Bé, xanh nhạt CV% 3,1 2,2 2,4 LSD0,05 0,16 0,11 0,12 MS Knud* Knudson C Hình 4. Ảnh hưởng của môi trường nền đến khả năng nhân nhanh chồi Kết quả phân tích phương sai cho thấy, môi trường nền có ảnh hưởng tới khả năng nhân nhanh chồi, mắt đốt lan Kim tuyến. Theo kết quả ở Bảng 3.4 thấy rằng môi trường Knud* cho số lượng chồi (3,67 chồi/mẫu) và số lá (4,12 lá/chồi) nhiều hơn ở môi trường MS (số lượng chồi 2,11 chồi/mẫu và số lá 1,55 lá/chồi) và Knudson (số lượng chồi 2,06 chồi/mẫu và số lá 2,35 lá/chồi). Đồng thời, trong môi trường Knud* thì chiều dài chồi (3,57cm) dài hơn hẳn so với hai môi trường còn lại (MS là 1,33 cm và Knudson là 2,22 cm) và chất lượng chồi cũng tốt hơn chồi mập, xanh. Như vậy, môi trường nền thích hợp nhất cho nuôi cấy mô lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus) là nuôi trường có nguồn gốc Knud*.
  42. 46. 3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất điều hòa sinh trưởng riêng rẽ và phối hợp đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân Chất điều hoà sinh trưởng không những là công cụ hữu ích giúp chúng ta nghiên cứu sâu hơn về sự phát sinh hình thái thực vật mà còn giúp ta chủ động định hướng cho sự phát triển của thực vật trong ống nghiệm. Đặc biệt với mục đích nhân giống tạo số lượng lớn trong thời gian ngắn thì việc sử dụng các loại chất điều tiết sinh trưởng ở nồng độ khác nhau cho tỷ lệ mẫu tái sinh lớn nhất là tất yếu. 3.2.2.1. Ảnh hưởng của nhóm chất Cytokinin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân Cytokinin được biết đến là nhóm chất điều hòa sinh trưởng có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trưởng của chồi in vitro (Miller, 1961). Để tăng hệ số nhân giống, người ta tăng nồng độ cytokinin trong môi trường nuôi cấy ở giai đoạn tạo chồi in vitro (Nguyễn Quang Thạch, 2007). Các loại cytokinin thường được sử dụng trong nuôi cấy như: BAP, Kinetin, TDZ, Zeatin… Trong thí nghiệm này, hai loại cytokinin là BAP và Kinetin được dùng với các nồng độ khác nhau là 0,1; 0,5; 1,0 và 2,0 mg/l trên môi trường (Knud* + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar). Kết quả thu được ở Bảng 3.5.
  43. 47. Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nhóm chất Cytokinin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân (kết quả theo dõi sau 8 tuần) Cytokinin Nồng độ (mg/l) Số chồi (chồi/mẫu) Số đốt (đốt/chồi) Chiều cao TB chồi (cm) Đặc điểm chồi 0 (ĐC) 0 1,22 1,54 2,32 Gầy, xanh nhạt BAP 0,1 2,44 2,16 3,03 Yếu, xanh nhạt 0,5 3,94 2,31 3,16 Khỏe, xanh đậm 1,0 5,22 2,93 3,23 Khỏe, xanh đậm 2,0 4,22 2,37 3,02 Xanh nhạt, có lông tơ CV% 2,8 2,4 1,6 LSD0,05 0,17 0,1 0,085 Kinetin 0,1 2,33 1,98 2,45 Yếu, xanh nhạt 0,5 4,22 2,45 3,05 Khỏe, xanh đậm 1,0 4,89 2,68 3,23 Khỏe, xanh đậm 2,0 3,22 2,02 3,08 Xanh nhạt CV% 2,6 2,7 1,6 LSD0,05 0,15 0,1 0,081 0,1 0,5 1,0 2,0 (mg/l) Ảnh hưởng của BAP 0,1 0,5 1,0 2,0 (mg/l) Ảnh hưởng của Kinetin Hình 5. Ảnh hưởng của nhóm chất cytokinin tới sự phát sinh hình thái và hệ số nhân
  44. 48. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân chồi Kết quả xử lý thống kê hàm Anova một nhân tố cho thấy, giữa các công thức có sự khác biệt rõ rệt về số lượng chồi, số đốt và chiều cao chồi ở độ tin cậy 95% và khác biệt so với đối chứng. Theo kết quả thu được ở Bảng 3.5 cho thấy, môi trường có bổ sung 1,0 mg/l BAP cho số chồi và số đốt cao hơn nhất (5,22 chồi/mẫu và 2,93 đốt/chồi), chiều cao chồi cũng lớn nhất (3,23 cm). Ở các môi trường có nồng độ BAP khác thì thấp hơn, số lượng chồi khi sử dụng nồng độ 0,1 mg/l BAP là 2,44 chồi/mẫu, ở nồng độ 0,5 mg/l BAP là 3,94 chồi/mẫu, ở nồng độ 2,0 mg/l là 4,22 chồi/mẫu và đối chứng là 1,22 chồi/mẫu, số đốt khi sử dụng các nồng độ 0,1; 0,5; 2,0 mg/l BAP lần lượt là 2,16; 2,33; 2,35 đốt/chồi và đối chứng là 1,54 đốt/chồi. Về chất lượng chồi thì ở nồng độ 1,0 mg/l BAP cũng cho chất lượng chồi tốt nhất chồi to khỏe, xanh đậm còn ở nồng độ 0; 0,1 và 2,0 mg/l thì do nồng độ quá cao và quá thấp nên chồi nhỏ và yếu, xanh nhạt. Như vậy, việc bổ sung BAP ở nồng độ 1,0 mg/l là thích hợp nhất cho sự phát sinh hình thái và hệ số nhân chồi lan Kim tuyến. Ảnh hưởng của Kinetin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân chồi Kết quả xử lý thống kê hàm Anova một nhân tố cho thấy, giữa các công thức có sự khác biệt rõ rệt về số lượng chồi, số đốt và cả chiều cao chồi ở độ tin cậy 95% và khác biệt so với đối chứng. Theo kết quả thu được ở Bảng 3.5 cho thấy, môi trường có bổ sung 1,0 mg/l Kinetin cũng cho số chồi và số đốt cao hơn nhất (4,91 chồi/mẫu và 2,68 đốt/chồi), chiều cao chồi cũng lớn nhất (3,23 cm). Ở các môi trường có nồng độ Kinetin khác thì thấp hơn, số lượng chồi dao động từ 2,33 – 4,22 chồi/mẫu, số đốt dao động từ 1,98 – 2,45 đốt/chồi. Về chất lượng chồi thì ở nồng độ 1,0 mg/l BAP cũng tốt nhất chồi to khỏe, xanh đậm còn ở nồng độ 0; 0,1 và 2,0 mg/l thì chồi nhỏ, xanh nhạt.
  45. 49. Như vậy, bổ sung Kinetin cũng ở nồng độ 1,0 mg/l là thích hợp nhất cho sự phát sinh hình thái và hệ số nhân chồi lan Kim tuyến. 3.2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA và αNAA đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân lan Kim tuyến (A. setaceus) Tác dụng rõ nét nhất của auxin đối với sự phân hóa tế bào là khả năng phát sinh rễ đã được kiểm chứng từ năm 1934 (Went, Skoog, Thimann). Nhiều nghiên cứu đã cho thấy vai trò của IBA và αNAA tác động đến quá trình phát sinh rễ trên nhiều đối tượng nghiên cứu như cây lát hoa Côn Đảo, tram Úc… (Trần Văn Minh và Cộng sự, 2003; Nguyễn Văn Nghi và Cộng sự, 2003). Để kiểm tra ảnh hưởng của auxin (IBA và NAA) tới sự phát sinh hình thái và hệ số nhân, thí nghiệm này được tiến hành trên môi trường Knud* và bổ sung riêng rẽ IBA và αNAA với các nồng độ khác nhau 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 3,0mg/l + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 7g/l agar. Kết quả thu được ở Bảng 3.6.
  46. 50. Bảng 3.6. Ảnh hưởng của auxin (IBA và αNAA) tới sự phát sinh hình thái lan Kim tuyến Auxin (mg/l) Chiều dài chồi (cm) Số chồi (chồi/mẫu) Số đốt (đốt/chồi) Chiều dài TB rễ (cm) Số rễ (rễ/chồi) Đặc điểm chồi 0 (ĐC) 3,33 1,33 2,13 0,92 2,04 Xanh nhạt, lá bé IBA 0,5 3,12 3,28 2,31 1,12 1,43 Xanh nhạt, có lông tơ 1,0 3,22 3,36 2,52 0,88 1,10 Xanh đậm, lá bé 1,5 3,55 4,87 2,66 0,98 0,96 Xanh đậm, lá to 2,0 3,23 2,28 2,39 1,05 0,83 Xanh nhạt, lá bé 3,0 2,12 2,33 2,58 1,17 0,71 Xanh nhạt, lá bé CV% 2,2 4,1 3,7 3,3 3,5 LSD0,05 0,13 0,095 0,16 0,059 0,13 αNAA 0,5 3,23 3,06 2,54 1,57 1,68 Bé, xanh nhạt 1,0 3,41 4,56 2,87 1,33 2,20 Xanh đậm, Lá to 1,5 3,33 3,78 2,30 0,83 1,42 Bé, xanh nhạt 2,0 3,37 3,11 1,97 1,32 1,32 Bé, xanh nhạt 3,0 3,67 2,67 1,79 1,12 1,21 Bé, xanh nhạt CV% 1 2,9 4 2,4 2,1 LSD0,05 0,6 0,14 0,16 0,051 0,13


【#7】Nghiên Cứu Nhân Nhanh In Vitro Loài Lan Kim Tuyến (Anoectochilus Setaceus Blume) Nhằm Bảo Tồn Nguồn Dược Liệu Quý

Đặt vấn đề

Từ xưa đến nay, lan vẫn được biết đến như một loài hoa quý phái, hoa của bậc vua chúa vương giả. Lan được phát hiện đầu tiên vào những năm 40 của thế kỷ VIII, cho đến nay đã có hơn 15.000 loại lan trồng khác nhau trên trên thế giới.

Tại Việt Nam, hoa lan cũng vô cùng đa dạng phong phú, có khoảng hơn 1.000 loài hoa các loại, chúng sinh sản tại các vùng rừng, núi như Cao Bằng, Lào Cai, Huế, Quy Nhơn, Đà Lạt, Pleiku, … lan Việt Nam đẹp thanh cao lại chứa đựng nhiều ý nghĩa, có rất nhiều cây quý hiếm và có những cây trước kia chỉ thấy mọc ở Việt Nam (như lan nữ hài Paphiopedilum delenati).

Họ lan (Orchidaceae) là một trong số những họ thực vật đa dạng nhất của Việt Nam, với tổng số khoảng 865 loài thuộc 154 chi. Thông thường lan được sử dụng làm cảnh. Ngoài ra, có nhiều loài lan còn được sử dụng làm thuốc.

Chi lan Kim tuyến Anoectochilus ở Việt Nam hiện thống kê được 12 loài, trong đó có loài lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume, tên khác Anoectochilus roxburghii Wall. ex Lindl. phân bố rộng ở hầu hết các tỉnh trong cả nước, được biết đến nhiều không những bởi giá trị làm cảnh, mà bởi giá trị làm thuốc của nó. Do bị thu hái nhiều để bán làm thuốc từ rất lâu, nên loài lan Kim tuyến đang bị đe dọa nghiêm trọng, rất có thể sẽ bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên nếu chúng ta không có biện pháp bảo tồn hữu hiệu. Hiện nay, lan Kim tuyến được cấp báo trong Nghị định 32/2006/NĐ-CP thuộc nhóm IA, nghiêm cấm khai thác sử dụng vì mục đích thương mại và nhóm thực vật rừng đang nguy cấp EN A1a,c,d, trong sách đỏ Việt Nam 2007. Vì vậy, nghiên cứu kỹ thuật nhân giống loài lan Kim tuyến – Anoectochilus setaceus Blume được triển khai sẽ cung cấp những cơ sở khoa học và thực tiễn để tạo ra hàng loạt những cây con ổn định về mặt di truyền nhằm bảo tồn và phát triển loài dược liệu nguy cấp, quí hiếm này.

Xuất phát từ những cơ sở đó, chúng tôi đã lựa chọn và thực hiện nghiên cứu đề tài:”Nghiên cứu nhân nhanh in vitro loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) nhằm bảo tồn nguồn dược liệu quý”.

I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu chung về cây Lan Kim tuyến

Chi lan Kim tuyến (Anoectochilus) còn được gọi là lan trang sức vì vẻ đẹp hấp dẫn của nó, được Carlvon Blume mô tả đầu tiên năm 1810 thuộc phân họ Orchidoideae. Trên thế giới đã thống kê được 51 loài. Ở Việt Nam hiện thống kê được 12 loài, trong đó loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) được biết đến chủ yếu với công dụng làm thuốc.

Lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume)

Đồng danh là (Anoectochilus roxburghi Wall.)

Họ: Phong lan (Orchidaceae)

Bộ: Phong lan (Orchidales)

Đây là loài đơn thân, mọc ở đất, có thân rễ mọc dài; thân trên đất mọng nước và có nhiều lông mềm, mang 2 – 4 lá mọc xoè sát đất. Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, chóp hơi nhọn và có mũi ngắn, cỡ 3 – 4 x 2 – 3 cm, mặt trên màu nâu thẫm có vệt vàng ở giữa và màu hồng nhạt trên các gân, mặt dưới màu nâu nhạt. Cuống lá dài 2 – 3 cm. Cụm hoa dài 10 – 15 cm, mang 4 – 10 hoa mọc thưa. Lá bắc hình trứng, dài 8-10 mm, màu hồng. Hoa thường màu trắng, dài 2,5 – 3 cm; môi dài đến 1,5 cm, ở mỗi bên gốc mang 6 – 8 dải hẹp, chẻ đôi thành 2 thuỳ hình thuôn tròn. Bầu dài 13mm, có lông thưa.

Mùa hoa tháng 2, tháng 4. Tái sinh bằng chồi từ thân rễ và hạt ít, sinh trưởng rất chậm. Là loại cây ưa bóng, kỵ ánh sáng trực tiếp thường mọc dưới tán rừng nguyên sinh, rừng rậm nhiệt đới ở độ cao 500 – 1600m. Mọc rải rác vài ba cây trên đất ẩm, giàu mùn và lá cây rụng.

Phân bố: Việt Nam: Lào Cai (Sapa), Hà Giang (Quản Bạ), Yên Bái, Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Hà Tây (Mỹ Đức: Chùa Hương), Quảng Trị (Đồng Chè), Kontum (Đắc Tô: Đắc Uy), Gia Lai (Kbang: Kon Hà Nừng)….Thế giới: Trung Quốc (Vân Nam, Quảng Đông), Ấn Độ, Lào, Inđônêxia,…

Tác dụng dược lý: Lan Kim tuyến là loài cây thuốc rất đặc biệt có tác dụng tăng cường sức khoẻ, làm khí huyết lưu thông, có tính kháng khuẩn, chữa các bệnh viêm khí quản, viêm gan mãn tính, chữa suy nhược thần kinh. Loài lan này được dùng làm thuốc chữa bệnh trị lao phổi, phong thấp, đau nhức khớp xương, viêm dạ dày mãn tính (Nguyễn Tiến Bân, Dương Đức Huyến). Trước đó, lan Kim tuyến (A. setaceus) là một trong những dược thảo quý giá, giúp bổ máu, dưỡng âm, chữa trị nóng phổi và nóng gan (Tạ A Mộc và Trần Kiến Đào, 1958). Hơn nữa mới đây người ta đã phát hiện ra khả năng phòng và chống ung thư của loại thảo dược này.

Theo các tài liệu nghiên cứu của Trung Quốc công bố gần đây bằng kỹ thuật sắc ký lỏng, sắc ký cột và kỹ thuật quang phổ đã phân lập, xác định được cấu trúc hoá học và thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất có trong loài lan Kim tuyến (Tạp chí “Sinh học thực vật tổng hợp Trung Quốc”, tập 48 số 3, tháng 3/2006, trang 359-363). Bằng các kỹ thuật quang phổ đã xác định được 8 hợp chất hoá học. Các hợp chất này đều có hoạt tính sinh học mạnh, có khả năng làm giảm các gốc tự do trong cơ thể, nên có khả năng phòng bệnh rất tốt. Đặc biệt có hai axít hữu cơ được phân lập là Olenolic acid và Ursolic acid có khả năng chống ung thư, giảm cholesterol máu, chống tăng huyết áp, kháng khuẩn…

1.1.1. Đặc điểm hình thái

Lan Kim tuyến là cây thảo, mọc ở đất, có thân rễ mọc dài; thân trên đất mọng nước, mang các lá mọc xòe sát đất.

a. Thân rễ

Lan Kim tuyến là cây thân rễ nằm ngang sát mặt đất, đôi khi hơi nghiêng, bò dài. Chiều dài thân rễ từ 5-12 cm, trung bình là 7,87 cm. Đường kính thân rễ từ 3-4 mm, trung bình là 3,17 mm. Số lóng trên thân rễ từ 3-7 lóng, trung bình là 4,03 lóng. Chiều dài của lóng từ 1-6 cm, trung bình là 1,99 cm. Thân rễ thường có màu xanh trắng, đôi khi có màu nâu đỏ, thường nhẵn, không phủ lông.

b. Thân khí sinh

Cây lan Kim tuyến có thân khí sinh thường mọc thẳng đứng trên mặt đất, ít khi mọc nghiêng. Chiều dài thân khí sinh từ 4-8 cm, trung bình 6 cm. Đường kính thân khí sinh từ 3- 5 mm, trung bình là 3,08 cm. Thân khí sinh mang nhiều lóng, các lóng có chiều dài khác nhau. Số lóng trên thân khí sinh thay đổi từ 2-4 lóng, trung bình là 2,87. Chiều dài mỗi lóng từ 1-4 cm, trung bình 2,23 cm. Thân khí sinh thường mọng nước, nhẵn, không phủ lông; thường có màu xanh trắng, đôi khi có màu hồng nhạt.

c. Rễ

Rễ lan Kim tuyến được mọc ra từ các mẫu trên thân rễ. Đôi khi rễ cũng được hình thành từ thân khí sinh. Rễ thường đâm thẳng xuống đất. Thông thường mỗi mẫu chỉ có một rễ, đôi khi có vài rễ cùng được hình thành từ một mấu trên thân rễ. Số lượng và kích thước rễ cũng rất thay đổi tuỳ theo cá thể. Số rễ trên một cây thường từ 3 – 10, trung bình là 5,4. Chiều dài của rễ thay đổi từ 0,5 – 8 cm, rễ dài nhất trung bình là 6,07cm và ngắn nhất trung bình là 1,22 cm, chiều dài trung bình của các rễ trên một cây là 3,82 cm.

d. Lá

Lá lan Kim tuyến mọc cách xoắn quanh thân, xoè trên mặt đất. Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, đầu lá hơi nhọn và có mũi ngắn, thường dài từ 3 – 5 cm, trung bình là 4,03 cm và rộng từ 2 – 4 cm, trung bình là 3,12 cm. Lá có màu nâu đỏ ở mặt trên và phủ lông mịn như nhung. Hệ gân lá mạng lưới lông chim, thường có 5 gân gốc. Các gân này thường có màu hồng ở mặt trên và nổi rất rõ. Đôi khi gân ở giữa có màu vàng nhạt. Mặt dưới lá có màu nâu đỏ nhạt, nhẵn với 5 gân gốc nổi rõ. Các gân bên ở phía rìa lá nổi rõ, gân ở giữa lá ở mặt dưới không rõ. Cuống lá dài 0,6 – 1,2 cm, thường nhẵn và có màu trắng xanh, đôi khi hơi đỏ tía ở bẹ lá. Bẹ lá nổi rõ và nhẵn. Số lá trên một cây thay đổi từ 2 – 6, thông thường có 4 lá. Kích thước của lá cũng thay đổi, các lá trên một cây thường có kích thước khác nhau rõ rệt.

e. Hoa, quả

Hoa lan Kim tuyến dạng cụm, dài 10 – 20 cm ở ngọn thân, mang 4 – 10 hoa mọc thưa. Lá bắc hình trứng, dài 6 – 10 mm, màu hồng. Các mảnh bao hoa dài khoảng 6 mm; cánh môi màu trắng, dài đến 1,5 cm, ở mỗi bên gốc mang 6 – 8 dải hẹp, đầu chẻ đôi. Mùa hoa tháng 10 – 12. Mùa quả chín tháng 12 – 3 năm sau.

1.1.2. Đặc điểm phân bố

1.1.2.1. Phân bố theo kiểu rừng: Kết quả điều tra đã chỉ ra rằng, hiện nay lan Kim tuyến hầu hết phân bố ở kiểu rừng kín lá rộng thường xanh á nhiệt đới núi thấp, cấu trúc rừng thường có 2 tầng cây gỗ. Đôi khi có thể gặp lan Kim tuyến ở kiểu rừng kín lá rộng thường xanh mưa mùa nhiệt đới.

– Tầng ưu thế sinh thái A2: Độ tán che thường từ 85-90%, với các loài cây gỗ chủ yếu như: Chắp tay bắc bộ (ExbuckLandia tonkinensis), Chắp tay (ExbuckLandia populnea), Thích các loại (Acer spp.), Trương vân (Toona surenii), Gội nếp (Aglaia spectabilis), Trám trắng (Canarium album), Kháo thơm (Machilus odoratissima), Sồi phảng (Lithocarpus cerebrinus), Dẻ gai bắc bộ (Castanopsis tonkinensis), Trâm trắng (Syzygium chanlos), Côm tầng (Elaeocarpus griffithii), Trâm tía (Syzygium sp.), Vỏ sạn (Osmanthus spp.), Thừng mực mỡ (Wrightia laevis), Máu chó (Knema spp.), v.v. Chiều cao của tầng A2 từ 15-25 m.

– Tầng cây gỗ A3: Bao gồm các loài cây của tầng trên còn nhỏ và các loài cây của tầng dưới như: Hoa trứng gà (Magnolia coco), Trứng gà 3 gân (Lindera sp.), Phân mã tuyến nổi (Archidendron chevalieri), Phân mã (Archidendron balansae), Mắc niễng (Eberhardtia tonkinensis), Nanh chuột (Cryptocarya lenticellata), Re hương (Cinnamomum iners), Re bầu (Cinnamomum bejolghota), Mò roi (Litsea balansae), Trà hoa vàng (Camelia spp.), Xoan đào (Prunus arborea), Trọng đũa (Ardisia spp.), v.v. Chiều cao của tầng A3 từ 815m.

– Tầng cây bụi B: Gồm các loài thực vật như Mua đất (Melastoma sp.), Ớt sừng lá nhỏ (Kibatalia mycrophylla), Lấu (Psychotria rubra), Ớt rừng (Clausena sp.), Bọt ếch (Glochidion hirsutum), v.v…

– Tầng cỏ quyết: Bao gồm chủ yếu các loài Thường sơn (Dichroa febrifuga), Cao cẳng (Ophiopogon spp.), Gừng một lá (Zingiber monophyllum), Giềng tàu (Alpinia chinensis), Sẹ (Alpinia tonkinensis), Mía dò (Costus speciosus), Mía dò bắc bộ (Costus tonkinensis), Râu hùm (Tacca spp.), Cỏ lá tre (Centosteca latifolia), Rớn đen (Adiantum flabellulatum), Hèo (Calamus rhabdocladus), Lòng thuyền (Curculigo gracilis), Móc (Caryota mitis), v.v…

– Thực vật ngoại tầng: Bao gồm các loài thuộc chủ yếu các họ Mã Tiền (Loganiaceae), họ Cau (Arecaceae), họ Na (Annonaceae), họ Kim cang (Smilacaceae), họ Củ nâu (Dioscoreaceae), họ Cà phê (Rubiaceae), họ Đậu (Fabaceae), họ Vang (Caesalpiniaceae), họ Trinh nữ (Mimosaceae), họ Ráy (Araceae), họ Thiên lý (Asclepiadaceae), họ Bòng bong (Schizaeaceae). Điển hình như: Dây hoa dẻ (Desmos chinensis), Dây dất na (Desmos spp.), Dây kim cang các loại (Smilax spp.), Củ nâu (Dioscorea cirrhosa), Móc câu đằng (Uncaria sp.), Ráy leo (Pothos scandens), Dây sưa (Dalbergia candenatensis), Dây móng bò (Bauhinia sp.), Bòng bong các loại (Ligodium spp.), Dây thèm bép (Tetrastigma rupestre), v.v…

– Mật độ phân bố: Của Lan Kim tuyến ở đây là rất thấp, trung bình khoảng 20 cây/ha. Chúng phân bố rải rác ở một số điểm thuộc khu vực nghiên cứu.

1.1.2.2. Phân bố lan Kim tuyến theo trạng thái rừng và sinh cảnh

– Theo trạng thái rừng: Kết quả điều tra đã khẳng định, lan Kim tuyến phân bố tập trung chủ yếu ở trạng thái rừng IIIA2, thuộc vùng lõi của Vườn quốc gia. Độ tán che của trạng thái rừng này từ 85-90%. Đặc điểm của cây bụi và thảm tươi ở khu vực Lan Kim tuyến phân bố là thưa thớt, độ che phủ thấp thường vào khoảng từ 15-30%, với độ cao của lớp cây bụi và thảm tươi khoảng từ 0,1-0,5m tuỳ từng khu vực. Lan Kim tuyến thường ít phân bố ở những nơi cây bụi thảm tươi dày đặc. Chúng có thể nằm ngay trên lớp thảm mục của rừng đang bị phân huỷ.

– Về sinh cảnh: Lan Kim tuyến chủ yếu phân bố trên đất, chúng mọc sát ngay bề mặt đất, nơi đất giàu mùn, độ ẩm và độ xốp cao, thoáng khí; thậm chí ngay trên lớp thảm mục của rừng đang phân huỷ. Đôi khi chúng mọc trên các tảng đá ẩm, trên các đoạn thân cây gỗ mục, trong gốc cây. Có thể bắt gặp lan Kim tuyến ở trong rừng nơi ẩm ướt, ven các khe suối, dưới tán rừng cây gỗ lớn, hoặc dưới rừng trúc, rừng sặt, trên đường mòn đi lại trong rừng.

1.1.2.3. Phân bố lan Kim tuyến theo địa lý, địa hình và đai cao

– Về địa lý, địa hình: Có thể gặp chúng ở hầu hết các dạng địa hình, như chân núi, sườn núi, đỉnh núi.

– Về đai cao: Lan Kim tuyến thường phân bố ở đai cao trên 735m, tập trung chủ yếu ở độ cao trên 970m, quanh núi Rùng Rình.

1.2. Nhân giống cây lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus)

1.2.1. Nhân giống bằng hạt

Nhân giống bằng hạt hay con gọi là nhân giống hữu tính, trong thiên nhiên sự thụ phấn của lan do côn trùng thực hiện, cấu trúc hoa hoàn toàn thích ứng với sự thụ phấn đó. Hoa lan là một loại hoa lưỡng tính, nhưng do cấu trúc của hoa và sự chín của các cơ quan sinh dục trong hoa không đều nên sự giao phấn nhờ sâu bọ có tính bắt buộc đối với tất cả các loài setaceus. Sự thụ phấn của hoa trong môi trường tự nhiên được côn trùng thực hiện trên cơ sở của mùi thơm, mật, màu sắc sặc sỡ và những cấu tạo của hoa là những nhân tố chính để thu hút các tác nhân thụ phấn từ khoảng cách xa.

Ở vườn nuôi trồng lan để đảm bảo kết quả của sự giao phấn cao và tạo ra các giống lai theo ý muốn, con người phải tiến hành thụ phấn nhân tạo. Sự thụ phấn có thể cùng cây, có thể khác cây.

Phương pháp này có nhiều ưu điểm: Dễ làm, giá thành hạ, thu được nhiều cây khoẻ, không bị bệnh, ngoài ra do đặc điểm giao phấn chéo có thể thu được những dòng biến dị cho vật liệu chọn tạo giống. Tuy nhiên trong thực tế hạt Lan Kim tuyến rất hiếm, số lượng hạt rất nhiều nhưng tỉ lệ nảy mầm ít, hơn nữa thời gian khá lâu để cây ra hoa có chất lượng tốt.

1.2.2. Nhân giống bằng cây con

Khi rễ cây con tương đối nhiều, cây có từ 3-5 lá, cây cứng cáp có thể tách để trồng riêng. Đây là cách nhân giống đơn giản và dễ làm nhất.

1.2.3. Phương pháp giâm cây

Lấy một giả hành cắt ra làm nhiều đoạn, mỗi đoạn có nhiều mấu. Đặt các đoạn này vào một nơi ẩm; chỉ cần cát và rêu. Sau vài tuần sẽ xuất hiện những cây con có thể đem trồng vào các chậu mới.

Phương pháp này là phương pháp cổ điển, dễ làm, quen với tập quán, kinh nghiệm của người lao động, giá thành thấp. Tuy nhiên phương pháp này cũng có một số trở ngại như: chậm (tăng khoảng 2-4 cây/năm), chất lượng giống không cao, cây hoa trồng lâu bị thoái hoá, bệnh virus có nhiều khả năng lan truyền và phát triển, từ đó làm giảm phẩm chất hoa (Nguyễn Xuân Linh, 1998)[5a].

1.2.4. Nhân giống in vitro

Nhân giống in vitro là một trong 4 lĩnh vực ứng dụng chính của công nghệ tế bào thực vật và đã mang lại hiệu quả kinh tế lớn nhất (Lê Trần Bình,

1997)

Kỹ thuật nhân nhanh in vitro nhằm phục vụ các mục đích sau:

Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm và làm vật liệu cho công tác tạo giống.

Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các loại cây trồng khác nhau như cây lương thực có củ, các loại cây rau, cây hoa, cây cảnh, cây dược liệu thuộc nhóm thân thảo.

Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quý của giống cây lâm nghiệp và gốc ghép trong nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh thuộc nhóm cây thân gỗ.

Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng và cách ly tái nhiễm kết hợp với làm sạch virus.

Bảo quản các tập đoàn giống nhân vô tính và các loại cây giao phấn trong ngân hàng gen.

1.2.4.1. Cơ sở khoa học của nhân giống in vitro

Tính toàn năng của tế bào (totipotency), từ năm 1902 nhà khoa học người Đức HaberLandt đã đề xướng ra phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh cho tính toàn năng của tế bào thực vật. Theo ông, mỗi tế bào được lấy từ bất kỳ cơ quan sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Khả năng này do mỗi tế bào đều chứa bộ gen mang thông tin di truyền của toàn bộ cơ thể, khi được đặt vào môi trường thích hợp tế bào này sẽ có khả năng giống như một hợp tử ban đầu.

Một đặc tính quan trọng khác, làm cơ sở cho nuôi cấy mô tế bào thực vật là khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào. Khả năng biệt hóa là sự biến đổi của tế bào từ tế bào phôi thành toàn bộ các tế bào chức năng trong các cơ quan của cơ thể. Ngược lại, khi được đặt vào môi trường thích hợp, các tế bào chuyên hóa của cơ thể có thể trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên sinh ra nó – tế bào phôi. Tuy nhiên, thực tế nghiên cứu đã chứng minh, khả năng phản biệt hóa của các tế bào là khác nhau, các tế bào chuyên hóa sâu như tế bào của hệ thống mạch dẫn thực vật, tế bào thần kinh động vật, khả năng biệt hóa rất khó xảy ra. Đối với thực vật, khả năng hình thành cơ quan hay cơ thể giảm dần theo chiều từ ngọn xuống gốc (Galson, 1986; Murashige, 1974).

Trong tự nhiên, tất cả các loài sinh vật đều tồn tại trong mình tiềm năng sinh sản dù là vô tính hay hữu tính, như thế các loài mới có thể duy trì được kiểu gen của mình, chiến thắng trong quá trình tiến hóa. Nhưng ngay từ khi ra đời, công nghệ nuôi cấy mô đã trở thành công cụ đắc lực phục vụ mục đích nhân giống của con người. Vậy tại sao lại phải tiến hành nhân giống in vitro? Chúng ta hãy xem xét những ý nghĩa to lớn mà nó mang lại cho nhân loại.

1.2.4.2. Ý nghĩa của nhân giống in vitro

Nuôi cấy mô tế bào thực vật, thực chất là một phương pháp nhân giống vô tính. Đối với nhiều loại thực vật quý hiếm, có giá trị kinh tế và ý nghĩa sinh học cao, gặp khó khăn trong vấn đề nhân giống hữu tính thì nhân giống vô tính in vitro là công cụ vô cùng hữu ích. Nhưng trên thực tế có nhiều loại thực vật nhân giống hữu tính bằng hạt có hệ số nhân cao nhưng vẫn tiến hành nhân giống vô tính in vitro là do:

Các phương pháp nhân giống hữu tính bằng hạt mặc dù cho hệ số nhân giống cao, dễ bảo quản và vận chuyển nhưng với một số cây trồng, khi nhân giống bằng hạt sẽ cho các cây con không hoàn toàn giống bố mẹ cả về hình thái và thành phần hóa học (Calson, 1964). Sự không đồng nhất này gây ra khó khăn trong việc đưa cây vào sản xuất theo dây truyền công nghiệp, vì các cây có chất lượng sản phẩm không đồng đều, làm giảm giá trị thương phẩm. Đặc biệt, đối với các cây thuốc thì việc không đồng nhất về chất lượng hay chính là hàm lượng các chất hoạt tính sẽ dẫn đến hậu quả là nguyên liệu không ổn định, không đáp ứng được nhu cầu sản xuất. Ví dụ: đối với các cây lấy tinh dầu, việc nhân giống bằng hạt dẫn tới sự phân ly không đều về hàm lượng các thành phần hoạt chất. Theo Nilov (1936), cây Lavanda khi nhân giống bằng hạt, hàm lượng tinh dầu ở cây con phân ly từ 0,5 đến 11,3 %, hàm lượng lynalylacetat từ 11 đến 78 %; cây bạc hà nhân giống hữu tính có sự phân ly rất lớn về hàm lượng và thành phần tinh dầu (Bùi Thị Hằng, Popov, 1975; Bogonina, 1969; Murray, 1960)…

Để khắc phục những nhược điểm trên, phương pháp nhân giống vô tính được áp dụng đã mang lại nhiều hiệu quả kinh tế và ý nghĩa sinh học lớn. Phương pháp nhân giống vô tính đã khắc phục được nhiều nhược điểm của nhân giống hữu tính, ưu điểm lớn nhất của nhân giống vô tính là các cây con đồng đều về mặt di truyền do duy trì được các tính trạng của cây mẹ (Petrop, 1989), nên có thể áp dụng sản xuất đại trà cho sản phẩm có chất lượng ổn định; rút ngắn thời gian từ khi trồng đến thu hoạch tạo điều kiện cho tăng vụ, tăng sản lượng đối với những cây có thời gian nảy mầm của hạt kéo dài… Mặc dù vậy, phương pháp nhân giống vô tính truyền thống (chiết, giâm, ghép) vẫn còn nhiều nhược điểm như sự lây nhiễm bệnh qua nguyên liệu thường phổ biến và phức tạp, hệ số nhân thấp: cam thảo là 5 – 7 (Shah, Dalal, 1980), bạc hà piperita là 2-3 (Foldeli, Havas, 1979), … hơn nữa, việc sử dụng chính các bộ phận làm thuốc để nhân giống rất lãng phí, tốn kém.

Để khắc phục các nhược điểm của phương pháp nhân giống vô tính truyền thống, một phương pháp nhân giống khác đã áp dụng rộng rãi trên thế giới cũng như ở Việt Nam, đó là phương pháp nhân giống in vitro, phương pháp này có nhiều ưu điểm nổi trội như:

– Hệ số nhân giống cao, từ một cây trong vòng một năm có thể tạo thành hàng triệu cây. Hệ số nhân giống ở các loại cây khác nhau nằm trong phạm vi 36 đến 1012 / năm, cao hơn bất cứ phương thức nhân giống nào. Ví dụ: từ một củ khoai tây, sau 8 tháng nhân giống người ta thu được 2000 triệu củ đồng nhất di truyền, được trồng trên một vùng rộng 40 ha, có nghĩa là tốc độ nhân giống vô tính lớn hơn 100.000 lần so với sinh sản hữu tính (Senez, 1987).

– Tính đồng nhất và ổn định di truyền cao: Các cây con được tạo ra giống hệt với cây bố mẹ ban đầu. Theo lý thuyết từ bất kỳ một cây chọn lọc ưu việt nào đều có thể tạo ra một quần thể với độ đồng đều cao, số lượng không hạn chế.

– Nâng cao chất lượng giống do tạo được các giống sạch bệnh, loại bỏ được các nguồn vi khuẩn, virus, nấm bệnh. Trong công tác nhân giống, vấn đề được quan tâm hàng đầu là số lượng và chất lượng giống. Bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta đã tạo được những giống cây hoàn toàn sạch virus. Limasset và Cornel (1949) đã chứng minh được rằng, số lượng virus được giảm dần ở các bộ phận gần đỉnh sinh trưởng, riêng đỉnh sinh trưởng thì hoàn toàn sạch virus (Morel and Martin, 1952). Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thường kết hợp với việc xử lý nhiệt độ cao để tạo ra nguyên liệu giống sạch bệnh. Bằng cách này, ở khoai tây, virus A, X và Y đã bị loại trừ còn virus M và S được giảm đi một cách đáng kể (Kassanis, 1950; Thomson, 1956-1958; Wang and Huang, 1975).

– Nhân giống in vitro có thể nhân nhanh cây không kết hạt hoặc kết hạt kém trong những điều kiện sinh thái nhất định. Như ở cây cọ dầu, phải mất 1015 năm mới cho thu hoạch, việc chọn, tạo và nhân nhanh được một giống mới rất khó khăn. Nhưng bằng phương pháp nhân nhanh in vitro, người ta có thể cung cấp được 500000 cây con giống hệt nhau trong vòng một năm (Staritsky, 1970).

1.2.4.3. Các phương thức nhân giống vô tính in vitro

Quá trình thực hiện nhân giống in vitro tạo ra các dòng vô tính, theo Shull (1912) dòng vô tính là một nhóm cá thể có kiểu gen tương tự nhau, chúng được nhân bằng sinh sản vô tính, các dòng vô tính này sẽ được tạo ra theo các phương thức sau:

– Tái sinh cây trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng, phôi, ngọn chồi, chồi nách.

– Tái sinh cây gián tiếp thông qua giai đoạn hình thành mô sẹo.

* Tái sinh cây trực tiếp từ mẫu nuôi cấy là quá trình phát động những điểm tồn tại sẵn có trong mô nuôi cấy, phân chia và tái sinh thành cây. Các cây con này được phát sinh từ các đỉnh sinh trưởng có bộ nhiễm sắc thể 2n, hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền và duy trì được các tính trạng của cây mẹ (Hu and Xang, 1983). Tái sinh trực tiếp cũng có thể xuất phát từ những tế bào không nằm trên đỉnh sinh trưởng, đó là các đoạn thân, mảnh lá, cuống lá, mảnh hoa… Trong trường hợp này, các tế bào thường phân chia nhưng không hình thành các tế bào mô sẹo mà tạo thành các điểm sinh trưởng cao hơn ở trường hợp nói trên.

* Con đường tái sinh gián tiếp, mẫu cấy khi nuôi trong môi trường thích hợp, thường là với auxin, có thể đem lại sự gia tăng thành khối tế bào không tổ chức, đó chính là các tế bào mô sẹo. Trong nuôi cấy, sự tăng sinh này có thể được duy trì nhiều hay ít là không hạn định, chỉ cần mô sẹo được cấy chuyển sang môi trường mới theo chu kỳ. Tuy nhiên, tế bào mô sẹo khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền. Để tránh tình trạng này nên sử dụng các loại mô sẹo vừa mới phát sinh. Nuôi cấy mô sẹo có vai trò vô cùng quan trọng trong công nghệ sinh học thực vật. Tỷ lệ auxin và cytokinin trong môi trường có thể dẫn tới sự phát triển của ngọn, rễ hay phôi soma; từ đó có thể tạo thành cây hoàn chỉnh. Nuôi cấy mô sẹo cũng có thể được sử dụng để mở đầu nuôi cấy tế bào dịch huyền phù, tạo ra hạt nhân tạo.

1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy

1.3.1. Ảnh hưởng của điều kiện khử trùng mẫu cấy

Việc khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy là một ấn đề cần thiết, vì mẫu cấy ở trong tự nhiên tiếp xúc với môi trường xung quanh nên mang rất nhiều vi khuẩn, nấm… Nhưng, do mức độ nhiễm của mỗi loại mẫu là khác nhau và đặc điểm của từng loại mẫu cũng khác nhau nên cần có sự thử nghiệm về khử trùng mẫu cấy nhằm thu được lượng mẫu vô trùng nhiều mà tốn ít nhiên liệu ban đầu.

Khả năng tiêu diệt nấm và khuẩn của hóa chất khử trùng phụ thuộc vào nồng độ, thời gian xử lý và mức độ xâm nhập của chúng vào các ngõ ngách trên bề mặt của mô cấy.

Thời gian khử trùng là một điều kiện quan trọng, nó phụ thuộc vào từng loại dung dịch khử trùng và đặc điểm của từng loại mẫu cấy. Với hypoclorite, người ta thường khử trùng trong thời gian 15-30 phút, HgCl2 thường có thời gian ít hơn. Thời gian quá lâu, dung dịch khử trùng xâm nhập vào mẫu có thể gây chết mẫu, thời gian quá ngắn sẽ không loại bỏ hết nấm và vi khuẩn nên mẫu dễ bị nhiễm.

Sau khi khử trùng, mẫu cây được đặt vào các môi trường nuôi cấy, từ đây giai đoạn nuôi cấy in vitro bắt đầu. Thành phần của môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng quyết định tới nuôi cấy.

1.3. 2. Ảnh hưởng của các thành phần hóa học

Trong nuôi cấy in vitro, cả yếu tố hóa học và yếu tố vật lý của cây trong các bình nuôi đều phải được cung cấp đầy đủ. Môi trường dinh dưỡng phải cung cấp tất cả các ion khoáng cần thiết, nguồn chất hữu cơ bổ sung như amino acid và vitamin, nguồn cacbon cố định, và một thành phần cần cho sự sống cũng phải được cung cấp đó là nước. Các nhân tố vật lý như nhiệt độ, pH, môi trường khí, ánh sáng và áp lực thẩm thấu, cũng phải được duy trì trong giới hạn chấp nhận.

Hiện nay trên thế giới có rất nhiều môi trường được sử dụng như môi trường Murashige và Skoog (1962), môi trường Gamborg (1968), môi trường Knop (1974), môi trường Anderson, Went, Knudson, Lindemann…Trong đó môi trường MS được đánh giá là phù hợp rộng rãi nhất với nhiều loại cây trồng, bao gồm cả cây hai lá mầm và cây một lá mầm. Thông thường trong một môi trường nuôi cấy phải đảm bảo các thành phần hóa học sau:

Các nguyên tố khoáng

Tùy theo nồng độ sử dụng, các nguyên tố khoáng được chia vào hai nhóm là nguyên tố đa lượng và nguyên tố vi lượng.

* Nguyên tố đa lượng: Các nguyên tố này thường chiếm 0,1 % khối lượng khô của thực vật. Nitơ, phốt pho, kali, magiê, canxi, và lưu huỳnh là các muối vô cơ. Chúng có mặt trong các hợp chất quan trọng (diệp lục. protein, acid nucleic, acid amin…), tham gia vào các quá trình như điều chỉnh áp suất thẩm thấu tế bào, vận chuyển năng lượng trong hô hấp, quang hợp, thực hiện vai trò tín hiệu tế bào,…

* Nguyên tố vi lượng: Được cung cấp với lượng rất thấp cho thực vật sinh trưởng, phát triển và có nhiều vai trò khác nhau. Mangan, iốt, đồng, coban, bo, mo, sắt và kẽm là các nguyên tố vi lượng, ngoài ra niken và nhôm cũng được tìm thấy trong một số công thức. Nguyên tố vi lượng thường có mặt trong thành phần của một số coenzyme, vitamin; tham gia vào các phản ứng trao đổi điện tử, sinh tổng hợp diệp lục,…

Chất hữu cơ bổ sung

* Các vitamin là những chất hữu cơ tham gia vào cấu trúc enzyme và cofactor trong nhiều phản ứng sinh hóa (Vũ Văn Vụ, 2006). Các loại vitamin B1, B6, PP và myoinositol là cần thiết cho nuôi cấy tế bào thực vật in vitro. Tuy nhiên, vì lý do lịch sử các loại vitamin khác nhau cũng được thêm vào để nuôi cấy.

* Các amino acid có vai trò quan trọng trong việc phát sinh hình thái, amino acid, aLanine, glutamic acid, glutamine và proline cũng được sử dụng nhưng trong nhiều trường hợp là không cần thiết.

Nguồn cacbon

Các mô và tế bào thực vật nuôi cấy nói chung, không thể tự quang hợp hoặc quang hợp yếu do thiếu clorophin và các điều kiện khác…do đó phải bổ sung thêm cacbon. Saccharose thường được sử dụng làm nguồn cacbon do đó những đặc tính như rẻ, dễ kiếm, đồng hóa triệt để và tương đối ổn định. Ngoài ra, các loại đường khác như glucose, maltose, galactose và sorbitol cũng có thể được sử dụng và trong những trường hợp đặc biệt có thể cung cấp tốt hơn đường saccharose.

Đường vừa là nguồn cacbon cung cấp cho mẫu nuôi cấy, đồng thời còn tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu của môi trường. Đường đóng góp khoảng 50-70 % vào khả năng thẩm thấu của môi trường (Trigiano and Gray, 2000). Thông thường đường saccharose được sử dụng ở nồng độ 0,2-0,3 %, nhưng nồng độ này có sự thay đổi ở từng đối tượng khác nhau và mục đích nuôi cấy khác nhau, có khi xuống tới 0,2 % (tạo dòng), có khi tăng lên đến 12 % (gây cảm ứng stress nước).

Sự hình thành rễ đòi hỏi một lượng đường được cung cấp từ quang hợp hoặc ngoại sinh. Theo George (1993) hầu hết các loại thực vật khi ra rễ thích hợp với lượng đường 20-30 g/lít. Tuy nhiên, cũng có loài yêu cầu nguồn carbohydrate ngoại sinh cao hơn. Ví dụ theo Sharma (1993) cây Gentiana kurroo chỉ có thể ra rễ tốt khi bổ sung 60 g/lít saccharose trong môi trường.

Thí nghiệm áp dụng phương pháp quang tự dưỡng cho thấy các cây in vitro đã phát triển tốt trên môi trường không có đường và vitamin, độ thoáng khí cao. Tỷ lệ nhiễm nấm giảm đáng kể. Cây có diện tích lá lớn hơn và sự đóng mở của lá theo quy luật tự nhiên ngay khi gặp điều kiện thay đổi của môi trường. Trong khi đó cây nuôi cấy theo điều kiện truyền thống (có đường và vitamin) có diện tích lá nhỏ, khí khổng luôn luôn ở trạng thái mở trong nhiều giờ khi chuyển từ điều kiện in vitro ra vườn ươm. Tỷ lệ sống 95-100 % sau một tháng ở vườn ươm đối với cây nuôi cấy trên môi trường không có đường, trái lại chỉ từ 70-80 % theo phương pháp truyền thống (Nguyễn Thị Quỳnh và cộng sự, 2005).

Chất điều tiết sinh trưởng

Chất điều tiết sinh trưởng thực vật là thành phần môi trường khắt khe trong việc xác định con đường phát triển của tế bào thực vật. Các chất điều tiết sinh trưởng được sử dụng thông thường là các hormome thực vật hoặc các chất tổng hợp tương tự chúng, phổ biến là auxin và cytokinin, gibberellins, abscisic acid, ethylene. Trong đó auxin và cytokinin là hai nhóm được sử dụng phổ biến nhất.

* Nhóm auxin gồm một số hợp chất có chứa nhân idol trong phân tử. Trong nuôi cấy in vitro, auxin thúc đẩy sinh trưởng của mẫu do hoạt hóa sự phân chia và giãn nở của tế bào, kích thích các quá trình tổng hợp và trao đổi chất, tham gia điều chỉnh sự phân hóa của rễ, chồi…(Bhojwani and Razdan, 1983).

Các auxin được sử dụng với nồng độ thấp từ 10-6 – 10-1 M tùy theo từng chất, mục đích và đối tượng nghiên cứu. Hàm lượng auxin thấp sẽ kích thích sự phân hóa rễ, hàm lượng cao kích thích hình thành mô sẹo.

Auxin được chia thành hai nhóm có nguồn gốc khác nhau: trong các auxin tự nhiên, quan trọng nhất là IAA. Nhưng IAA chỉ được dùng trong một số môi trường nuôi cấy do có đặc tính không ổn định với nhiệt độ và ánh sáng. Vì vậy, các amino acid kết hợp với IAA ổn định hơn được sử dụng phổ biến hơn làm giảm bớt liên kết khi sử dụng IAA. Nhóm auxin tổng hợp tương tự IAA được sử dụng rộng rãi hơn trong các môi trường nuôi cấy như 2,4-D, IBA. NAA.

* Cytokinin kích thích sự phân chia và ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của tế bào, cảm ứng hình thành chồi phụ và loại bỏ ưu thế ngọn (Nguyễn Như Khanh, 2002). Trong nuôi cấy mô thực vật cytokinin được dùng để kích thích sự phát sinh chồi, sử dụng kết hợp với auxin kích thích phân chia tế bào. Nồng độ cytokinin cao kìm hãm sự hình thành và phát triển của rễ (Narayaswamy, 1994). Trong các cytokinin tự nhiên có hai nhóm được sử dụng trong môi trường nuôi cấy, đó là zeatin và 2iP (2-isopentyl adenine). Nhưng chúng không được dùng phổ biến vì rất đắt (đặc biệt là zeatin) và không ổn định. Các chất tổng hợp tương tự như kinetin và BAP được sử dụng phổ biến hơn. Các chất hóa học không có based purin và thay thế bằng phenylureas, cũng được sử dụng như cytokinin trong môi trường nuôi cấy tế bào thực vật.

Trong cây có sự cân bằng nội hoocmone (Vũ Văn Vụ, 2007). Do vậy, khi sử dụng các chất điều tiết sinh trưởng trong nuôi cấy cần đặc biệt lưu ý để sử dụng nồng độ thích hợp đạt hiệu quả cao. Nhiều tác giả đã tổng kết, tỷ lệ auxin/cytokinin nếu nghiêng về phía auxin sẽ kích thích hình thành rễ; nghiêng về phía cytokinin sẽ thúc đẩy hình thành chồi; ở tỷ lệ trung gian sẽ hình thành mô sẹo.

Than hoạt tính

Than hoạt tính ban đẫu được bỏ sung vào môi trường nuôi cấy để cố gắng mô phỏng điều kiện trồng trọt, sau đó nó được sử dụng rộng rãi trong nhiều môi trường nuôi cấy. Nhiều nghiên cứu cho thấy tác dụng của than hoạt tính trong môi trường nuôi cấy mô thực vật. Đó là: sự hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol, các sản phẩm trao đổi thứ cấp, ảnh hưởng tới pH, xúc tác bẻ gãy đường saccharose trong khử trùng (S.C. Van Winkle et al, 1995). Ngoài ra than cũng hút các chất hữu cơ như phytohormone, vitamin, sắt, kẽm, … (Nissen & Sutter, 1990).

Điều tra tác dụng của than hoạt tính, sự khử trùng, và môi trường nuôi cấy trong thủy phân đường cho thấy, sự thủy phân của đường trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào cả ion H+ và sự khử trùng và thành phần than hoạt tính. Sau khử trùng, ở môi trường MS + 5 % saccharose bổ sung than hoạt tính cho tỷ lệ đường thủy phân là 70 %, tỷ lệ tương ứng ở môi trường Gamborg là 56 %, còn ở môi trường không có than hoạt tính là 20 % (Pan and Staden, 1999).

Như vậy than hoạt tính có ảnh hưởng rõ ràng tới môi trường nuôi cấy, nhiều nghiên cứu đã cho thấy tác dụng kích thích của mô in vitro như kích thích tạo củ của hoa Lili (Nhut et al, 2001), tác dụng hình thành rễ ở Pawlownia (Lê Thị Kim Đào, 2001)…

Các chất hữu cơ bổ sung

Ngoài các thành phần dinh dưỡng bắt buộc kể trên trong môi trường nuôi cấy mô tế bà thực vật in vitro, người ta còn bổ sung thêm một số thành phần hỗn hợp tự nhiên khác như nước dừa, dịch chiết nấm men, nước ép cà chua, khoai tây, chuối… Các thành phần này thường chứa nguồn dinh dưỡng và chất điều hòa sinh trưởng đa dạng như amino acid, đường, vitamin, nucleic acid, auxin, cytokinin.

Nước dừa là thành phần khá phổ biến trong nhiều môi trường nuôi cấy. Tất cả phân tích thành phần của nước dừa từ non tới già của Tulecke et al.,(1961) cho thấy trong nước dừa có: amino acid, acid hữu cơ, đường, RNA, DNA, Inositol, auxin, cytokinin,… Hàm lượng sử dụng của nước dừa từ 10-20 %.

Tác nhân làm đặc môi trường

Tùy thuộc vào loại sinh trưởng, môi trường nuôi cấy cần được sử dụng ở dạng lỏng hoặc đặc, nhiều loại môi trường nuôi cấy đòi hỏi tế bào hoặc mô thực vật phải sinh trưởng trên bề mặt, agar là tác nhân làm đặc môi trường được sử dụng phổ biến nhất. Agar được sản xuất từ tảo biển, loại tinh khiết hay agarose có thể cũng được sử dụng, nhưng có thể khác nhau về độ đặc.

1.3.3. Ảnh hưởng của các yếu tố vật lý

Các yếu tố vật lý chính là ánh sáng, nhiệt độ, độ pH, trạng thái môi trường,…

Nhiệt độ trong phòng nuôi cấy mô thường được điều chỉnh ổn định từ 220C đến 250C. Tuy nhiên tùy từng loại nuôi cấy và đối tượng nuôi cấy mà có sự điều chỉnh nhiệt độ phù hợp. Theo nhiều nghiên cứu trong nuôi cấy mô sẹo, huyền phù tế bào với mục đích sản xuất các hợp chất thứ sinh thì sự điều chỉnh nhiệt độ rất có ý nghĩa, cảm ứng cho tế bào sinh trưởng, phân chia và tiết các hợp chất thứ sinh. Nhiệt độ còn ảnh hưởng tới nuôi cấy thông qua tác đông tới cấu trúc của các chất điều hòa sinh trưởng như IAA, GA3,… pH môi trường pH của môi trường cũng là một yếu tố rất quan trọng, ảnh hưởng tới trạng thái lý hóa của các chất trong môi trường, do đó ảnh hưởng tới khả năng điện ly của các muối, sự thủy phân hóa các chất… Thông thường pH được điều chỉnh ở mức 5,5 – 5,8.

Sự phát triển của mô có thể bị thay đổi hoàn toàn nếu chúng nuôi cấy trên một môi trường đặc, lỏng hoặc nửa lỏng. Các mô nuôi cấy thường sinh trưởng tốt hơn trong môi trường lỏng, tuy nhiên môi trường lỏng cũng gây ra hiện tượng thủy tinh hóa, các mô nuôi cấy bị mọng nước gây khó khăn cho cấy chuyển và ra cây.

1.3.4. Ảnh hưởng của điều kiện ra cây

Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình sản xuất một cây giống in vitro. Mục đích của giai đoạn này nhằm đưa cây giống in vitro trong phòng nuôi ra ngoài tự nhiên; huấn luyện cây thích nghi với các điều kiện nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng tự nhiên và chuyển từ chế độ dị dưỡng sang chế độ tự dưỡng.

Mỗi loài cây có đặc điểm khác nhau, do đó để đạt tỷ lệ cây sống cao cần nghiên cứu để tìm giá thể phù hợp cho cây. Giá thể trồng cây có thể là cát, đất mùn hoặc các hỗn hợp nhân tạo không chứa đất, mùn cưa và bọt biển…

Cây nuôi cấy in vitro có đặc điểm là các khí khổng luôn mở. Vì vậy, khi chuyển cây ra vườn ươm, cây thường bị mất nước rất nhanh, do đó cần phải che phủ cẩn thận và cung cấp đủ độ ẩm cho cây bằng cách phun sương. Cần cung cấp cho cây lượng nước vừa đủ, lượng nước quá ít hoặc quá nhiều đều có ảnh hưởng không tốt cho cây.

Ngoài ra, ở giai đoạn đầu đưa ra ngoài vườn ươm, bộ rễ của cây nuôi cấy in vitro thường chưa có khả năng hấp thụ các chất ding dưỡng từ giá thể. Để tăng chất lượng của cây giống, có thể sử dụng các dung dịch dinh dưỡng để tưới cho cây.

1.4. Quy trình sản xuất cây cấy mô

Theo Debergh (1991) thì quy trình nhân giống được chia làm 5 giai đoạn: a) Lấy mẫu và xử lý mẫu

Đây là giai đoạn đầu tiên trong quy trình, cần đặc biệt chú ý vì những đặc tính của mẫu cấy sẽ được duy trì và nhân lên ở tất cả các cây giống sau này. Cần chọn lọc cây mẹ ưu việt, khỏe, có giá trị kinh tế cao; trên cây mẹ tiến hành chọn cơ quan, mô để lấy mẫu, thường là chồi non, đoạn thân có chồi ngủ, hoa non, lá non…

Khả năng nhiễm bệnh của mẫu phụ thuộc vào cách lấy mẫu, xử lý mẫu và điều kiện khử trùng. Mỗi loài cây có ngưỡng nhiệt độ và độ ẩm phù hợp khi bảo quản và xử lý mẫu. Với các cây cận nhiệt đới và nhiệt đới thì nhiệt độ 250C, độ ẩm 75 % là điều kiện giữ mẫu thích hợp, tỷ lệ nhiễm bệnh thấp (Deborgh and Zimmerman, 1991).

b) Tái sinh mẫu nuôi cấy

Mục đích của giai đoạn này là tái sinh các cơ quan từ mẫu nuôi cấy. Khả năng thành công của nuôi cấy mô tế bào thực vật phụ thuộc vào trạng thái tuổi của tế bào mẫu nuôi cấy, càng gần trạng thái phôi sinh thì khả năng tái sinh càng lớn. Sau một thời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào hoặc cơ quan (chồi, cụm chồi, rễ) hoặc các phôi vô tính có đặc tính gần như phôi hữu tính.

c) Nhân nhanh chồi

Cần tạo ra tốc độ nhân nhanh cao nhất trong điều kiện nuôi cấy, vì vậy thành phần và điều kiện môi trường phải được tối ưu nhằm đạt được mục tiêu nhân nhanh. Môi trường ở giai đoạn này cần bổ sung các hormone sinh trưởng (cytokinin, auxin), tăng thời gian chiếu sáng lên từ 16 giờ/ ngày, cường độ ánh sáng tối thiểu là 1000 lux, nhiệt độ thích hợp là từ 20 – 300C.

Quy trình cấy chuyển nhân nhanh chồi thông thường diễn ra trong khoảng 1-2 tháng tùy từng loại cây. Tỷ lệ nhân nhanh sau mỗi lần cấy chuyển đạt khoảng 2 – 8 lần/ 1 lần cấy chuyển. Giai đoạn nhân nhanh chồi từ một vài chồi ban đầu không nên kéo dài quá lâu để tránh biến dị soma. Ví dụ từ một chồi cây chuối chọn lọc ban đầu người ta chỉ nên nhân lên khoảng 2000 – 3000 chồi cây sau 7 – 8 lần cấy chuyển, đối với các cây khác như mía, cúc, hoa phong Lan sau một năm có thể nhân được trên 1 triệu chồi từ một cây mẹ ban đầu.

d) Tái sinh rễ

Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát rễ tự sinh, nhưng thông thường các chồi này phải được cấy chuyển sang một môi trường khác để kích thích tạo rễ. Môi trường tái sinh rễ thường được bổ sung auxin (NAA, IBA, 2,4-D) ở liều lượng thích hợp. Tuy nhiên, một số cây như chuối thì sự hình thành rễ tốt hơn ở môi trường không có chất sinh trưởng.

e) Chuyển cây ra vườn ươm

Các cây nuôi cấy in vitro sau khi đã tái sinh hoàn chỉnh sẽ được chuyển ra ngoài vườn ươm. Cây chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng. Vì vậy, cần huấn luyện cho cây thích nghi với sự thay đổi của môi trường.

1.5. Tình hình nghiên cứu cây lan Kim tuyến

1.5.1.Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Chi lan Kim tuyến (Anoectochilus) đã được nghiên cứu chủ yếu ở Trung Quốc một cách toàn diện cả về đặc điểm hình thái, kỹ thuật nhân giống, khả năng trồng, thành phần hóa học và công dụng phòng, chữa bệnh (Lai Wan Yu, Lai Wan Nian, 2005).

Chow và CS (1982) đã nghiên cứu về nguồn vật liệu sử dụng cho nhân sinh khối in vitro loài Anoectochilus formosanus rất đa dạng. Năm 1987, Liu và CS đã chọn chồi đỉnh để nuôi cấy mô. Cũng năm 1987, Ho và CS, năm 1992, Lee và CS đã sử dụng phôi hạt để làm nguồn vật liệu nuôi cấy.

Năm 2001, các tác giả Yih-juh Shiau, Abhay Psagare, Uei-Chin Chen, Shu-Ru Yang và Hsin-Sheng Tsay đã nghiên cứu thành công loài Lan Kim tuyến (Anoectochilus formosanus Hayata) từ hạt với công thức môi trường vào mẫu là: 1/2MS + 0,2% than hoạt tính + 8% dịch chiết chuối. Môi trường được sử dụng để nhân nhanh chồi là: 1/2MS + 0,2% than hoạt tính + 8% dịch chiết chuối + 2mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA.

Năm 2002, Tsay và CS đã cắt các mắt đốt thân lấy từ cây Anoectochilus Formosanus Hayata 2 năm tuổi cấy vào môi trường MS lỏng dung tích 500 ml + 2mg/l BAP + 0,5mg/l NAA + 2% than hoạt tính.

1.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước

Hiện nay, lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) được xếp trong nhóm IA trong sách đỏ Việt Nam, cần bảo tồn các quần thể nhỏ còn sót lại ở các Vườn Quốc gia và Khu Bảo tồn thiên nhiên, cũng như cần nghiên cứu nhân giống tạo hàng hóa xuất khẩu và bảo vệ nguồn gen. Ở Việt Nam do bị người dân thu hái tự phát để bán làm thuốc nên loài lan Kim tuyến đang bị đe dọa nghiêm trọng, rất có thể sẽ bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên nếu chúng ta không có biện pháp bảo tồn hữu hiệu. Mặc dù vậy cho đến nay, ở nước ta vẫn chưa có bất kì công trình nghiên cứu nào về kỹ thuật nhân giống, gây trồng cho loài cây quý này được công bố. Do vậy, có thể nói việc nghiên cứu nhân nhanh loài lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume bằng phương pháp nhân giống in vitro vừa có ý nghĩa lý luận và ý nghĩa về mặt thực tiễn.

Những năm gần đây, đã có một số đề tài nghiên cứu về đặc điểm hình thái, phân bố và kỹ thuật nhân giống in vitro loài lan Kim tuyến này như:

Năm 2004, Nguyễn Văn Kiệt cũng đã đưa ra quy trình nhân giống in vitro thành công cho loài lan Kim tuyến Anoectochilus formosanus với vật liệu ban đầu là từ chồi đỉnh tại đại học Chungbuk, Hàn Quốc. Môi trường tạo vật liệu khởi đầu là H3 (Hyponex: 6,5N-4,5P-19K 1g/l + 20N-20P-20K 1g/l) + 2g/l peptone. Môi trường nhân nhanh là: H3 + 1mg/l BAP (hoặc 1-2mg/l TDZ) + 1% than hoạt tính.

Năm 2010, Phùng Văn Phê, Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nguyễn Trung Thành. Đã đạt được những kết quả bước đầu trong nhân nhanh chồi in vitro loài Lan kim tuyến – Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl.

Năm 2010,Phan Ngọc Khoa, Trường Đại học Khoa học Huế đã nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến nhân giống in vitro lan Kim tuyến.”.

Các tác giả trên đã bước đầu tiến hành thăm dò ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng và bước đầu tiến hành nhân giống thử nghiệm lan Kim tuyến nhưng chưa tác giả nào đưa ra quy trình hoàn chỉnh để nhân giống loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume). Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi đặc biệt chú trọng đến nghiên cứu nhân nhanh và quy trình ra cây hoàn chỉnh cho loài thảo dược quý hiếm này.

II. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Cây lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume)

Mẫu chồi được tái sinh từ thân ngầm, thân khí sinh của cây lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) được thu từ Vườn quốc gia Tam Đảo, Vĩnh Phúc.

2.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

+ Địa điểm: Thí nghiệm được tiến hành tại Viện Sinh học Nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội và Phòng công nghệ tế bào Thực vật, Trung tâm Nghiên cứu Khoa học Sự sống, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên.

+ Thời gian: từ tháng 11/2011 – 12/2012

2.2. Mục tiêu nghiên cứu

– Xác định điều kiện khử trùng mẫu nuôi cấy thích hợp, tìm ra các môi trường thích hợp cho việc nhân nhanh in vitro.

– Xác định điều kiện ra cây và bước đầu đưa cây ra vườn ươm.

2.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

2.3.1. Ý nghĩa khoa học

– Đề tài sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học về loài lan (Anoectochilus setaceus Blume), chi Lan Kim tuyến.

– Cung cấp những cơ sở khoa học về quy trình nhân giống in vitro lan Anoectochilus setaceus Blume.

– Các kết quả nghiên cứu sẽ bổ sung thêm tài liệu khoa học phục vụ cho công tác giảng dạy, nghiên cứu khoa học về loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume).

2.3.2. Ý nghĩa thực tiễn

– Đề xuất được quy trình nhân giống in vitro cho lan Anoectochilus setaceus Blume.

– Góp phần bảo tồn, thúc đẩy sản xuất cây Anoectochilus setaceu Blume như một nghề trồng lan mang lại giá trị kinh tế cao.

2.4. Nội dung nghiên cứu

2.4.1. Nghiên cứu xác định chất khử trùng, thời gian khử trùng và cơ quan vào mẫu thích hợp.

2.4.2. Nghiên cứu xác định môi trường khởi động và nhân nhanh thích hợp.

+ Xác định môi trường nền thích hợp.

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của các nhóm chất điều tiết sinh trưởng đến sự phát sinh hình thành và hệ số nhân.

2.4.3. Nghiên cứu môi trường thích hợp cho sự ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh.

2.4.4. Nghiên cứu điều kiện ra cây thích hợp cho loài lan Kim tuyến (Anoectochilus Setaceus Blume).

2.5. Phương pháp nghiên cứu

Điều kiện nuôi cấy

– Mẫu được cấy trên môi trường đã được khử trùng ở 1,4 atm, 1210C

– pH của môi trường là: 5,4.

– Nhiệt độ phòng nuôi: 25±20C

– Cường độ ánh sáng: 2000 lux

– Thời gian chiếu sáng: 16 giờ chiếu sáng/ngày đêm

2.5.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm

A. Xác định các phương pháp khử trùng tạo mẫu sạch

Thí nghiệm 1. Xác định chất khử trùng thích hợp

Chồi và mắt đốt ngang thân cây lan Kim tuyến sau thu hái, được rửa sạch bằng xà phòng, sau đó được thử nghiệm khử trùng bằng cồn 70o và H2O2 0,01% trong các khoảng thời gian khác nhau. Sau đó được rửa sạch lại nhiều lần bằng nước cất vô trùng rồi cấy vào môi trường vào mẫu là: 1/2MS + 0.2% than hoạt tính + 0,8% dịch chiết chuối. Thí nghiệm được tiến hành với các công thức khử trùng:

CT1: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s. CT2: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 20s.

CT3: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 30s.

CT4: Ngâm trong NaClO 2% trong 5 phút (300s).

CT5: Ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút (600s).

CT6: Ngâm trong NaClO 2% trong 15 phút (900s).

CT7: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s rồi ngâm trong NaClO 2% trong 5 phút.

CT8: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s rồi ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút.

CT9: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s rồi ngâm trong NaClO 2% trong 15 phút.

Thí nghiệm 2. Xác định cơ quan vào mẫu thích hợp nhất cho việc tạo mẫu sạch

Các cơ quan khác nhau là: Chồi đỉnh, chồi nách, mắt đốt ngang thân được khử trùng bằng công thức khử trùng hiệu quả nhất (rút ra ở Thí nghiệm 1).

Theo dõi số mẫu sống, số mẫu bị nhiễm.

Thí nghiệm 3. Xác định cơ quan vào mẫu thích hợp đến hệ số nhân chồi in vitro

Cấy mẫu vào môi trường nhân cơ bản là MS + 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin + 100 ml/l ND + 100 g/l dịch chiết khoai tây + 20 g/l sucrose + 7 g/l agar.

Mỗi loại vật liệu (chồi đỉnh, chồi nách, mắt đốt ngang thân) được bố trí 3 lần lặp lại, mỗi lần 7 mẫu.

B. Xác định môi trường khởi động và nhân nhanh thích hợp

Khi các mẫu sạch bệnh được chuyển sang môi trường nhân nhanh. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện nuôi trồng khác nhau đối với quá trình nhân nhanh. Mỗi công thức được bố trí 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 7 mẫu, mỗi công thức là 21 mẫu.

Thí nghiệm 4. Xác định môi trường nền thích hợp cho nuôi cấy mô cây Lan Kim tuyến (A. setaceus)

Thí nghiệm được tiến hành dựa trên ba môi trường nền được sử dụng phổ biến hiện nay là MS, Knudson C và Knudson C cải tiến (Knud*). Các công thức được tiến hành trên nền môi trường chung là:

Nền môi trường = 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar.

CT1: Knud* + Nền môi trường

CT2: MS + Nền môi trường

CT3: Knudson C + Nền môi trường

Thí nghiệm 5. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất cytokinin (BAP và kinetin) đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân

Sau khi tìm ra môi trường nền thích hợp trong thí nghiệm 4, thí nghiệm 5 tiếp tục tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất cytokinin tới khả năng phát sinh chồi lan Kim tuyến. Trong đó, môi trường nền sử dụng chung cho các công thức là:

Nền môi trường = Môi trường nền (TNo4) + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar.

CT1: ĐC

CT2: Nền môi trường + 0,1mg/l BAP

CT3: Nền môi trường + 0,5mg/l BAP

CT4: Nền môi trường + 1,0 mg/l BAP

CT5: Nền môi trường + 2,0 mg/l BAP

CT6: Nền môi trường + 0,1mg/l Kinetin

CT7: Nền môi trường + 0,5mg/l Kinetin

CT8: Nền môi trường + 1,0 mg/l Kinetin

CT9: Nền môi trường + 2,0 mg/l Kinetin

Thí nghiệm 6. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất Auxin (IBA và α-NAA) đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân

Thí nghiệm tiếp tục được tiến hành trên nền môi trường trên và thăm dò ảnh hưởng của auxin với các nồng độ khác nhau

Nền môi trường = Môi trường nền (TNo4) + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar.

CT1: ĐC

CT2: Nền môi trường +0,5 mg/l IBA

CT3: Nền môi trường +1,0 mg/l IBA

CT4: Nền môi trường +1,5 mg/l IBA

CT5: Nền môi trường +2,0 mg/l IBA

CT6: Nền môi trường +3,0 mg/l IBA

CT7: Nền môi trường +0,5 mg/l α-NAA

CT8: Nền môi trường +1,0 mg/l α-NAA

CT9: Nền môi trường +1,5 mg/l α-NAA

CT10: Nền môi trường +2,0 mg/l α-NAA

CT11: Nền môi trường +3,0 mg/l α-NAA

Thí nghiệm 7. Nghiên cứu ảnh hưởng của sự phối hợp 2 nhóm chất là cytokinin và auxin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân

Qua các kết quả thực nghiệm cho thấy, nồng độ BAP và Kinetin khi sử dụng phối hợp là 0,5mg/l và 0,3mg/l do đó thí nghiệm sẽ tiếp tục thăm dò ảnh hưởng của sự phối hợp 2 nhóm chất trên dựa trên nền môi trường:

Nền môi trường = Môi trường nền (TNo4) + 0,5mg/l BAP + 0,3mg/l Kinetin + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar.

CT1: Nền môi trường +0,1mg/l IBA

CT2: Nền môi trường +0,3mg/l IBA

CT3: Nền môi trường +0,5mg/l IBA

CT4: Nền môi trường + 0,1mg/l α-NAA

CT 5: Nền môi trường +0,3mg/l α-NAA

CT6: Nền môi trường +0,5mg/l α-NAA

C. Nghiên cứu ra rễ tạo cây hoàn chỉnh

Khi các chồi lan Kim tuyến có chiều cao 3-4 cm, có 3-4 lá được cấy chuyển sang môi trường ra rễ. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền (không có chất điều tiết sinh trưởng) và than hoạt tính đến sự ra rễ. Mỗi công thức được bố trí 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 6 mẫu, mỗi công thức là 18 mẫu.

Thí nghiệm 8. Ảnh hưởng của môi trường nền (môi trường dinh dưỡng cơ bản) đến sự ra rễ

CT1: MS + 20g/l Sucrose + 7g/l agar

CT2: MS/2 + 20g/l Sucrose + 7g/l agar

CT3: Knud* + 20g/l Sucrose + 7g/l agar

CT4: Knud*/2 + 20g/l Sucrose + 7g/l agar

Thí nghiệm 9. Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến sự ra rễ

Các thí nghiệm được tiến hàn trên nền môi trường nghèo dinh dưỡng

CT1= ĐC= Nền = MS + 20g/l Sucrose + 0% than hoạt tính + 7g/l agar

CT2: Nền + 1% than hoạt tính

CT3: Nền + 3% than hoạt tính

CT4: Nền + 5% than hoạt tính

D. Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện chăm sóc tới khả năng sinh trưởng của loài lan Kim tuyến (Anoectochilus Setaceus Blume) in vitro ngoài vườn ươm.

Cây cao 3-4cm, mọc 3-4 lá và có 3-4 rễ đủ tiêu chuẩn đưa ra ngoài vườn ươm. Cây in vitro cho ra khỏi môi trường tạo rễ, rửa sạch agar bám trên rễ, rồi trồng trong giá thể ngoài vườn ươm.

* Cách bố trí thí nghiệm:

– Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, mỗi công thức lặp lại 3 lần, mỗi chậu trồng 3 cây.

– Định kì theo dõi: 7 ngày/1lần, chúng tôi đo chiều cao cây, đến rễ lá, số nhánh trong mỗi lần đo định kì.

– Số cây theo dõi

– Cách tưới: Phun mù dưới dạng sương mù vào lúc sáng sớm

Thí nghiệm 10. Nghiên cứu giá thể phù hợp cho việc ra cây loài Lan Kim tuyến (Anoectochilus Setaceus Blume) in vitro Giá thể:

CT 1: Giá thể 100% dớn

CT 2: Giá thể 50% Dớn + 50% xơ dừa

CT 3: Giá thể 100% xơ dừa

CT 4: Giá thể 100% bột dừa

Thí nghiệm 11. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian huấn luyện cây trong bình đến tỷ lệ sống của lan Kim tuyến khi trồng lên giá thể

Thí nghiệm được bố trí với thời gian huấn luyện cây khác nhau:

ĐC: 0 ngày CT1: 4 ngày CT2: 8 Ngày

CT3: 12 Ngày CT4: 16 ngày

Cây sau khi huấn luyện sẽ được trồng vào giá thể là dớn và xơ dữa trộn lẫn trong nhà lưới được che kín bằng lưới đen.

Thí nghiệm 12. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian che phủ ở nhà lưới đến tỷ lệ sống của lan Kim tuyến khi trồng lên giá thể

Cây Lan in vitro sau khi huấn luyện, đủ tiêu chuẩn đem ra trồng, sẽ được rửa sạch thạch và trồng lên giá thể ở nhà lưới. Luống cây sau khi trồng sẽ được che kín bằng nilon trắng, phía trên che bằng lưới đen có độ che sáng 50%. Thí nghiệm được bố trí với các khoảng thời gian che kín nilon khác nhau:

ĐC: 0 ngày CT1: 5 ngày CT2: 10 Ngày CT3: 15 Ngày

2.5.2. Phương pháp đánh giá kết quả và xử lý số liệu

Các chỉ tiêu theo dõi

12. Chỉ tiêu thu thập: Tỷ lệ sống của cây con, đặc điểm của cây con

13. Thời gian thu thập: cứ 1 tuần quan sát và ghi số liệu 1 lần.

III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu sạch và xác định cơ quan vào mẫu phù hợp cho việc nhân nhanh in vitro

Nhân giống in vitro có hệ số nhân giống cao, cây con tạo ra đồng nhất và sạch bệnh. Muốn vậy, trong bất kỳ quy trình nhân giống nào thì việc chọn vật liệu khởi đầu và việc tạo mẫu sạch in vitro chính là điều kiện tiên quyết để quyết định thành công của toàn bộ quá trình. Bởi vì đây chính là giai đoạn cung cấp nguồn mẫu sạch cho các giai đoạn tiếp theo của quá trình nhân giống.

Mẫu sạch in vitro được tạo ra từ nhiều nguồn, có thể là từ các bộ phận sinh dưỡng (thân, lá, rễ, phát hoa…) hoặc từ cơ quan sinh sản (quả). Trong nghiên cứu này các loại vật liệu đã sử dụng là thân khí sinh, thân ngầm được cắt đoạn và cho vào mẫu để lựa chọn loại mẫu cấy phù hợp.

3.1.1. Xác định chất khử trùng thích hợp

Khử trùng mẫu là khâu quan trọng nhằm loại bỏ các nguồn nấm, vi khuẩn, virus khỏi mẫu, thu được nguồn mẫu vô trùng cho các nghiên cứu tiếp theo. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới kết quả khử trùng như phương pháp lấy mẫu, thời điểm lấy mẫu, thời gian khử trùng, hóa chất khử trùng… Trong thí nghiệm này hóa chất được sử dụng là cồn 70⁰ và NaClO 2% bố trí ở các khoảng thời gian khác nhau. Sau khi khử trùng mẫu được cấy vào môi trường vào mẫu, sau một khoảng thời gian nhất định, thường là từ sau 2-3 tuần những mẫu sạch bắt đầu tái sinh. Đánh giá khả năng tái sinh là bước tiếp theo để tìm ra công thức khử trùng tốt nhất. Kết quả thu được sau 15 ngày thể hiện ở Bảng 3.1.

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đến hiệu quả tạo mẫu sạch cây lan Kim tuyến (kết quả theo dõi sau 15 ngày)

    Với chất khử trùng là cồn 70⁰ :

Cồn 700 là chất có tác dụng sát khuẩn và phá hủy thành cellulozo của tế bào thực vật nên khi kéo dài thời gian khử trùng thì tỷ lệ sống của mẫu giảm đồng thời tỷ lệ nhiễm cũng giảm. Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, thời gian khử trùng với cồn 70⁰ trong 10s (CT1) cho tỷ lệ mẫu sống cao nhất (47,62%) do thời gian ngắn thành tế bào ít bị phá hủy là nhưng tỷ lệ nhiễm cũng cao (52,38%) do chưa đủ để dung dịch khử trùng giết chết các nguồn bệnh. Khi tăng thời gian khử trùng lên 20s (CT2) thì tỷ lệ sống và tỷ lệ nhiễm giảm là 28,57% và 47,62%. Tiếp tục tăng thời gian khử trùng lên 30s (CT3) thì tỷ lệ sống tiếp tục giảm còn 14,29% và 38,1%.

    Với chất khử trùng là NaClO 2%

NaClO 2% là hóa chất có tính sát khuẩn cao nên khi tăng thời gian khử trùng thì tỷ lệ nhiễm sẽ giảm nhưng nếu thời gian khử trùng lâu thì dung dịch có thể xâm nhập vào bên trong gây độc với mẫu. Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, khi khử trùng trong thời gian 5 phút (CT4) thì tỷ lệ nhiếm cao (23,81%) do thời gian chưa đủ để diệt các nguồn bệnh. Khi tăng thời gian khử trùng lên 10 phút (CT5) thì tỷ lệ nhiễm thấp nhất (9,52%), tỷ lệ sống cao (57,14%). Tiếp tục tăng thời gian khử trùng lên tới 15 phút(CT6) dung dịch đã gây độc cho mẫu nên tỷ lệ sống thấp hơn (33,33%), tỷ lệ nhiễm tăng lên. Như vậy, thời gian khử trùng bằng NaClO 2% tốt nhất là trong 10 phút, cho tỷ lệ sống cao và tỷ lệ nhiễm thấp. Khử trùng bằng phương pháp kết hợp giữa cồn 70⁰ và NaClO 2%

Khi kết hợp cả hai chất khử trùng trên với thời gian khử trùng thích hợp đã khắc phục được các nhược điểm của từng chất nên cho tỷ lệ sống cao hơn và tỷ lệ nhiễm giảm. Kết quả thí nghiệm cho thấy, phương pháp khử trùng là ngâm cồn 70⁰ trong 10s rồi ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút (CT8) cho tỷ lệ sống cao nhất đạt 90,48% và tỷ lệ nhiễm thấp (28,57%).

Như vậy, thời gian khử trùng mẫu có ảnh hưởng khá lớn tới tỷ lệ sống của mẫu cấy. Công thức khử trùng CT8 (ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s rồi ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút) là vừa đủ, vừa có khả năng tiêu diệt mầm bệnh mà lại tác động nhẹ đến thành tế bào nên cho tỷ lệ sống cao và kích thích mẫu tái sinh.

3.1.2. Xác định cơ quan vào mẫu thích hợp để tạo mẫu sạch và tăng hệ số nhân chồi in vitro

Mục tiêu đặt ra của quy trình khử trùng cho bất kỳ loài cây nào đều là tạo được tỷ lệ mẫu sạch cao đồng thời có khả năng tái sinh mạnh. Một trong các yếu tố chính ảnh hưởng đến khả năng này là bản chất vật liệu làm mẫu cấy. Mẫu cấy tiếp xúc với nước, đất như rễ thường có lượng vi sinh vật rất cao và khó loại bỏ hoàn toàn chúng khỏi nguồn mẫu. Mẫu mọng nước, có lông thường khó khử trùng hơn những mẫu không mọng nước, bề mặt nhẵn.

Trong nghiên cứu này các vật liệu được khử trùng được khử trùng theo công thức khử trùng tốt nhất suy ra từ kết quả nghiên cứu phần 3.1.1

3.1.2.1. Ảnh hưởng của loại vật liệu đến tỷ lệ tạo mẫu sạch

Qua kết quả thí nghiệm 1 cho thấy, điều kiện khử trùng hiệu quả nhất đối với loài Lan Kim tuyến là: Ngâm trong cồn 70o trong 10s sau đó ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút. Do đó, để xác định cơ quan vào mẫu phù hợp nhất thí nghiệm tiếp tục áp dụng điều kiện khử trùng trên với các vật liệu khác nhau của cây lan Kim tuyến là: Chồi đỉnh, chồi nách, mắt đốt ngang thân. Kết quả thu được sau 15 ngày được thể hiện ở Bảng 3.2.

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của loại vật liệu đến tỷ lệ tạo mẫu sạch (Kết quả thu được sau 15 ngày)

Qua kết quả nghiên cứu ở thí nghiệm này cho thấy, cơ quan vào mẫu thích hợp cho việc tạo mẫu sạch là mắt đốt ngang thân.

3.1.2.2. Ảnh hưởng của cơ quan vào mẫu đến hệ số nhân chồi in vitro

C

ơ quan vào mẫu có ảnh hưởng rõ rệt đến hệ số nhân chồi. Ở một số loài, cơ quan vào mẫu có tỷ lệ mẫu sạch bệnh cao nhất nhưng lại cho hệ số nhân chồi thấp nhất. Do đó, để đạt hiệu quả nhân nhanh chồi in vitro loài lan Kim tuyến, chúng tôi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của cơ quan vào mẫu đến hệ số nhân chồi lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume). Kết quả thí nghiệm thu được thể hiện qua Bảng 3.3.

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của cơ quan vào mẫu đến hệ số nhân chồi in vitro (kết quả theo dõi sau 8 tuần).

Phân tích phương sai một nhân tố với 3 lần lặp của tỷ lệ mẫu sạch, hệ số nhân và chiều cao chồi đều được hiệu của trung bình mỗi công thức lớn hơn

LSD0,05 chứng tỏ cơ quan vào mẫu có ảnh hưởng rõ rệt đến tỷ lệ tạo chồi, hệ số nhân và chiều cao TB chồi ở độ tin cậy 95%.

Qua kết quả ở Bảng 3.3 cho thấy, khi cấy các vật liệu là chồi đỉnh, chồi nách, mắt đốt ngang thân vào môi trường nhân nhanh phù hợp, kết quả theo dõi sau 8 tuần cho thấy mắt đốt ngang thân là cơ quan tái sinh và phát triển tốt nhất với tỷ lệ tạo mẫu là 100%, hệ số nhân 4,56 lần, chồi dài 3,2 cm. Cơ quan nhân kém nhất là chồi đỉnh với tỷ lệ tạo chồi chỉ đạt 33,33%, hệ số nhân là 2,11 lần và chiều dài chồi là 2,6 cm. Chồi nách cho tỷ lệ tạo mẫu là 44,44%, hệ số nhân 3,5 lần và chiều dài chồi 2,95 cm.

Như vậy, cơ quan vào mẫu thích hợp nhất để tăng hệ số nhân chồi in vitro lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus) là mắt đốt ngang thân.

3.2. Nghiên cứu môi trường khởi động và nhân nhanh thích hợp

Trong nuôi cấy in vitro, môi trường nuôi cấy đóng vai trò quan trọng. Vừa phải cung cấp chất dinh dưỡng cho mẫu vừa phải biệt hoá mẫu theo những hướng xác định. Do đó nghiên cứu lựa chọn môi trường nuôi cấy phù hợp nhất sẽ cho hệ số nhân cao, chất lượng chồi tốt.

3.2.1. Xác định môi trường nền thích hợp cho nuôi cấy mô Lan Kim tuyến (A. setaceus)

Những nghiên cứu về nuôi cấy Phong lan in vitro cho thấy có một số môi trường thích hợp để nuôi cấy Phong lan như: MS; môi trường Knudson C cho Cattleya, Cymbidium (Adirti, 1993), môi trường Knudson cải tiến (Knud*), môi trường Hyponex (Lou and Kako,1995; Nakano et al, 2000…), môi trường Vaccin &Went… Trong đề tài này chúng tôi nghiên cứu nuôi cấy loài Lan Kim tuyến trên ba loại môi trường cơ bản: MS, Knudson C và Knud*.

Thể chồi 4 tuần tuổi từ môi trường vào mẫu được cấy vào các môi trường khác nhau là MS, Knud*, Knudson có bổ sung thêm 20g/l sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar. Sau 8 tuần nuôi cấy ta thu được kết quả sau:

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của môi trường nền đến khả năng nhân nhanh chồi, mắt đốt lan Kim tuyến

Kết quả phân tích phương sai cho thấy, môi trường nền có ảnh hưởng tới khả năng nhân nhanh chồi, mắt đốt lan Kim tuyến.

Theo kết quả ở Bảng 3.4 thấy rằng môi trường Knud* cho số lượng chồi (3,67 chồi/mẫu) và số lá (4,12 lá/chồi) nhiều hơn ở môi trường MS (số lượng chồi 2,11 chồi/mẫu và số lá 1,55 lá/chồi) và Knudson (số lượng chồi 2,06 chồi/mẫu và số lá 2,35 lá/chồi). Đồng thời, trong môi trường Knud* thì chiều dài chồi (3,57cm) dài hơn hẳn so với hai môi trường còn lại (MS là 1,33 cm và Knudson là 2,22 cm) và chất lượng chồi cũng tốt hơn chồi mập, xanh. Như vậy, môi trường nền thích hợp nhất cho nuôi cấy mô lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus) là nuôi trường có nguồn gốc Knud*.

3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất điều hòa sinh trưởng riêng rẽ và phối hợp đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân

Chất điều hoà sinh trưởng không những là công cụ hữu ích giúp chúng ta nghiên cứu sâu hơn về sự phát sinh hình thái thực vật mà còn giúp ta chủ động định hướng cho sự phát triển của thực vật trong ống nghiệm. Đặc biệt với mục đích nhân giống tạo số lượng lớn trong thời gian ngắn thì việc sử dụng các loại chất điều tiết sinh trưởng ở nồng độ khác nhau cho tỷ lệ mẫu tái sinh lớn nhất là tất yếu.

3.2.2.1. Ảnh hưởng của nhóm chất Cytokinin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân

Cytokinin được biết đến là nhóm chất điều hòa sinh trưởng có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trưởng của chồi in vitro (Miller, 1961). Để tăng hệ số nhân giống, người ta tăng nồng độ cytokinin trong môi trường nuôi cấy ở giai đoạn tạo chồi in vitro (Nguyễn Quang Thạch, 2007). Các loại cytokinin thường được sử dụng trong nuôi cấy như: BAP, Kinetin, TDZ, Zeatin…

Trong thí nghiệm này, hai loại cytokinin là BAP và Kinetin được dùng với các nồng độ khác nhau là 0,1; 0,5; 1,0 và 2,0 mg/l trên môi trường (Knud* + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar). Kết quả thu được ở Bảng 3.5.

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nhóm chất Cytokinin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân (kết quả theo dõi sau 8 tuần)

    Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân chồi

Kết quả xử lý thống kê hàm Anova một nhân tố cho thấy, giữa các công thức có sự khác biệt rõ rệt về số lượng chồi, số đốt và chiều cao chồi ở độ tin cậy 95% và khác biệt so với đối chứng.

Theo kết quả thu được ở Bảng 3.5 cho thấy, môi trường có bổ sung 1,0 mg/l BAP cho số chồi và số đốt cao hơn nhất (5,22 chồi/mẫu và 2,93 đốt/chồi), chiều cao chồi cũng lớn nhất (3,23 cm). Ở các môi trường có nồng độ BAP khác thì thấp hơn, số lượng chồi khi sử dụng nồng độ 0,1 mg/l BAP là 2,44 chồi/mẫu, ở nồng độ 0,5 mg/l BAP là 3,94 chồi/mẫu, ở nồng độ 2,0 mg/l là 4,22 chồi/mẫu và đối chứng là 1,22 chồi/mẫu, số đốt khi sử dụng các nồng độ 0,1; 0,5; 2,0 mg/l BAP lần lượt là 2,16; 2,33; 2,35 đốt/chồi và đối chứng là 1,54 đốt/chồi. Về chất lượng chồi thì ở nồng độ 1,0 mg/l BAP cũng cho chất lượng chồi tốt nhất chồi to khỏe, xanh đậm còn ở nồng độ 0; 0,1 và 2,0 mg/l thì do nồng độ quá cao và quá thấp nên chồi nhỏ và yếu, xanh nhạt.

Như vậy, việc bổ sung BAP ở nồng độ 1,0 mg/l là thích hợp nhất cho sự phát sinh hình thái và hệ số nhân chồi lan Kim tuyến.

    Ảnh hưởng của Kinetin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân chồi

Kết quả xử lý thống kê hàm Anova một nhân tố cho thấy, giữa các công thức có sự khác biệt rõ rệt về số lượng chồi, số đốt và cả chiều cao chồi ở độ tin cậy 95% và khác biệt so với đối chứng.

Theo kết quả thu được ở Bảng 3.5 cho thấy, môi trường có bổ sung 1,0 mg/l Kinetin cũng cho số chồi và số đốt cao hơn nhất (4,91 chồi/mẫu và 2,68 đốt/chồi), chiều cao chồi cũng lớn nhất (3,23 cm). Ở các môi trường có nồng độ Kinetin khác thì thấp hơn, số lượng chồi dao động từ 2,33 – 4,22 chồi/mẫu, số đốt dao động từ 1,98 – 2,45 đốt/chồi. Về chất lượng chồi thì ở nồng độ 1,0 mg/l BAP cũng tốt nhất chồi to khỏe, xanh đậm còn ở nồng độ 0; 0,1 và 2,0 mg/l thì chồi nhỏ, xanh nhạt.

Như vậy, bổ sung Kinetin cũng ở nồng độ 1,0 mg/l là thích hợp nhất cho sự phát sinh hình thái và hệ số nhân chồi lan Kim tuyến.

3.2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA và αNAA đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân lan Kim tuyến (A. setaceus)

Tác dụng rõ nét nhất của auxin đối với sự phân hóa tế bào là khả năng phát sinh rễ đã được kiểm chứng từ năm 1934 (Went, Skoog, Thimann). Nhiều nghiên cứu đã cho thấy vai trò của IBA và αNAA tác động đến quá trình phát sinh rễ trên nhiều đối tượng nghiên cứu như cây lát hoa Côn Đảo, tram Úc… (Trần Văn Minh và Cộng sự, 2003; Nguyễn Văn Nghi và Cộng sự, 2003).

Để kiểm tra ảnh hưởng của auxin (IBA và NAA) tới sự phát sinh hình thái và hệ số nhân, thí nghiệm này được tiến hành trên môi trường Knud* và bổ sung riêng rẽ IBA và αNAA với các nồng độ khác nhau 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 3,0mg/l + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 7g/l agar. Kết quả thu được ở Bảng 3.6.

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của auxin (IBA và αNAA) tới sự phát sinh hình thái lan Kim tuyến

Sau 8 tuần nuôi cấy trong môi trường có bổ sung auxin IBA và αNAA với các dải nồng độ từ 0,5-3,0 mg/l thu được kết quả trong Bảng 3.6. Kết quả cho thấy, IBA và αNAA có hiệu quả sản sinh rễ bất định, αNAA có hiệu quả sản sinh rễ lớn hơn IBA nhưng hiệu quả sản sinh rễ không rõ ràng ở cả 2 loại phytohormon trên. Số lượng rễ và chiều dài rễ không khác biệt nhiều giữa các công thức. Trái lại, hai loại auxin này lại có hiệu quả rõ rệt trong việc sản sinh chồi bất định và đạt kết quả lớn và khác biệt hẳn giữa các công thức. Cụ thể là IBA ở nồng độ (1,5mg/l) cho 4,87 chồi/mẫu và αNAA (1,0mg/l) cho 4,55 chồi/mẫu. Lá cây có màu xanh đậm nhưng kích thước lá nhỏ hơn so với cytokinin. Trong rất nhiều các thí nghiệm và tài liệu nghiên cứu, các loại auxin như IBA, αNAA, 2,4 D, IAA được sử dụng để sản sinh rễ cho hầu hết các loại cây nhưng trong thí nghiệm này, đối với cây lan Kim tuyến (A. setaceus) IBA và αNAA không có hiệu quả sản sinh rễ bất định.

3.2.2.3.Ảnh hưởng của sự phối hợp 2 nhóm chất là auxin và cytokinin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân

Nhiều tác giả đã tổng kết rằng sự biệt hóa cơ quan thực vật in vitro là kết quả tác động qua lại giữa hai nhóm auxin và cytokinin. Tỷ lệ auxin/cytokinin cao sẽ kích thích sự ra rễ, trái lại sẽ đẩy mạnh sự biệt hóa chồi, ở tỷ lệ trung bình thì hình thành mô sẹo. Để nghiên cứu nhân nhanh nhằm thu được các chồi có chất lượng tốt cho các giai đoạn tiếp theo, chúng tôi tiến phối hợp giữa BAP, Kinetin và αNAA, IBA với các nồng độ khác nhau kết thu được từ thí nghiệm trên, BAP và kinetin khi sử dụng phối hợp theo tỷ lệ 0,5mg/l BAP + 0,3mg/l kinetin cho hiệu quả nhân nhanh tốt. Do đó, thí nghiệm được tiến hành trên nền môi trường trên phối hợp với IBA và α-NAA với các dải nồng độ từ 0,1 – 0,5 mg/l + 20g/l Sucrose + 20g/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar. Kết quả thí nghiệm được thể hiện qua Bảng 3.6.

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của sự phối hợp 2 nhóm chất là auxin và cytokinin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân (kết quả theo dõi sau 8 tuần)

Theo kết quả ở Bảng 3.6: Mẫu cấy trên môi trường chứa tổ hợp 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin + 0,3mg/l α-NAA cho số chồi cao nhất đạt (6,56 chồi/mẫu) nhiều hơn so với môi trường chứa tổ hợp 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin + 0,5mg/l IBA (4,85 chồi/mẫu) nhưng số đốt và chiều cao chồi thì lại thấp hơn. Sự phối hợp giữa cytokinin và auxin cho số chồi, số đốt và chiều cao chồi cao nhất (6,56 chồi/mẫu, 2,77 đốt/chồi và chiều cao trung bình chồi đạt 3,52 cm).

Như vậy, qua kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng tới sự phát sinh hình thái và hệ số nhân chồi thấy rằng công thức môi trường thích hợp nhất để nhân nhanh là: Knud* +0,5mg/l BAP + 0,3mg/l Kinetin + 0,3 mg/l α-NAA + 20g/l Sucrose + 20g/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar cho hệ số nhân cao, chất lượng chồi tốt, xanh, lá khỏe.

3.3. Nghiên cứu ra rễ tạo cây hoàn chỉnh

Cây nuôi cấy mô in vitro trước khi chuyển ra vườn ươm thường phải có bộ rễ hoàn chỉnh. Nếu rễ kém phát triển sẽ làm cho quá trình hút nước cũng như khả năng bám đất của cây bị ảnh hưởng nhưng ngược lại, bộ rễ phát triển mạnh sẽ làm ảnh hưởng tới chất lượng của các cơ quan khác. Do đó cần nghiên cứu để tìm ra môi trường ra rễ thích hợp cho cây.

Khi các chồi đạt tiêu chuẩn cho ra rễ, có chiều cao 3 – 5 cm , có 3 – 4 rễ, chồi mập khỏe, lá to, xanh thì được chuyển sang các môi trường ra rễ để tạo cây hoàn chỉnh.

Qua thí nghiệm trên, hai loại auxin là IBA và α-NAA đã được tiến hành nghiên cứu và cho kết quả là không có khả năng sản sinh ra rễ bất định đối với lan Kim tuyến (A. setaceus). Do đó trong nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nghèo dinh dưỡng và than hoạt tính đến sự ra rễ ở cây lan Kim tuyến (A. setaceus).

3.3.1. Ảnh hưởng của môi trường nền (môi trường không có chất điều tiết sinh trưởng) đến sự ra rễ

Lan Kim tuyến là một loại cây có yêu cầu về dinh dưỡng thấp, khi sống ở các môi trường nghèo dinh dưỡng thì rễ lan Kim tuyến sẽ kéo dài hơn để lấy dinh dưỡng cho cây. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu cho cây ra rễ trên môi trường nền nghèo dinh dưỡng, không có chất kích thích sinh trưởng để đánh giá môi trường nền ra rễ thích hợp và đánh giá khả năng ra rễ của mẫu Lan Kim tuyến trong điều kiện nghèo dinh dưỡng. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.7.

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của môi trường nền (môi trường không có chất điều tiết sinh trưởng) đến sự ra rễ (kết quả theo dõi sau 8 tuần)

Theo kết quả ở Bảng 3.7 cho thấy, môi trường Knud*/2 cho tỷ lệ tạo rễ cao nhất (100%), số lượng rễ nhiều nhất (2,17 rễ/chồi) và chiều dài rễ cũng cao nhất (2,47 cm), chồi mập và dài. Các môi trường khác đều cho các chỉ tiêu này thấp hơn, tỷ lệ tạo chồi dao động từ 66,67 – 83,33%; số lượng rễ dao động từ 1,25 – 1,87 rễ/chồi; chiều dài rễ đao động từ 1,6 – 2,3 cm; chồi ngắn hơn.

Như vậy có thể thấy rằng môi trường nghèo dinh dưỡng sẽ kích thích bộ rễ Lan Kim tuyến phát triển mạnh hơn và phát triển theo hướng phát triển chiều dài rễ.

3.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến sự ra rễ

Vai trò tích cực của than hoạt tính đã được chứng minh trong nhiều nghiên cứu trên các đối tượng khác nhau. Theo đó, than hoạt tính có tác dụng hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol, các sản phẩm trao đổi thứ cấp… Và đặc biệt, than hoạt tính làm thay đổi môi trường ánh sáng do làm cho môi trường sẫm màu, nên có thể kích thích sự hình thành và sinh trưởng của rễ (Vũ Văn Vụ, 2006). Vì vậy, trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng than hoạt tính với các nồng độ khác nhau bổ sung vào môi trường Knud* + 20g/l Sucrose + 7g/l agar để xác định vai trò của than hoạt tính đối với sự ra rễ của cây Lan Kim tuyến.

Kết quả trình bày ở Bảng 3.8.

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến sự ra rễ (kết quả theo dõi sau 8 tuần)

Kết quả xử lý thống kê hàm Anova một nhân tố cho thấy, nồng độ than hoạt tính khác nhau rõ ràng có ảnh hưởng đến tỷ lệ tạo rễ và chiều dài rễ và số lượng rễ của Lan Kim tuyến nuôi cấy mô.

Kết quả ở Bảng 3.8 cho thấy, bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy rõ ràng là có ảnh hưởng tích cực hơn đến sự hình thành của rễ cây lan Kim tuyến. Ở tất cả các môi trường bổ sung than hoạt tính đều cho tỷ lệ tạo rễ là 100%. Bổ sung than hoạt tính ở nồng độ 5% cho số lượng rễ nhiều nhất (4,22 rễ/chồi) và chiều cao rễ là 3,5 cm. Trong khi đó ở các nồng độ khác thì số lượng rễ thấp hơn dao động từ 2 – 3,83 rễ/chồi, đối chứng chỉ có 1,25 rễ/chồi, chiều cao dao động từ 2,89 – 3,2 cm, đối chứng là 1,6 cm. Chất lượng rễ của mẫu cấy ở môi trường có bổ sung 5% than hoạt tính là dài, mập và rất khỏe, ở cá nồng độ khác thì rễ ngắn và yếu hơn.

Căn cứ vào các chỉ tiêu đánh, chúng tôi cho rằng, than hoạt tính ở nồng độ 5% là có tác dụng kích thích sự hình thành và phát sinh rễ lan Kim tuyến tốt nhất

3.4. Nghiên cứu điều kiện ra cây thích hợp cho loài lan Kim tuyến (A. setaceus Blume) in vitro

3.4.1. Nghiên cứu giá thể phù hợp nhất cho việc ra cây loài lan Kim tuyến (A.

setaceus Blume) in vitro

CT 1: Giá thể 100% dớn

CT 2: Giá thể 50% Dớn + 50% xơ dừa

CT 3: Giá thể 100% xơ dừa

CT 4: Giá thể 100% bột dừa

Các giá thể được làm sạch, sấy khô và được ngâm nước trước khi đưa vào sử dụng. Sau 2 tuần đưa cây ra ngoài giá thể chúng tôi thu được kết quả theo Bảng 3.9

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của giá thể tới sinh trưởng và tỷ lệ sống của cây lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume)

Từ Bảng kết quả thu được, chúng tôi nhận thấy trên các giá thể khác nhau, tỷ lệ sống sót, khả năng sinh trưởng, phát triển của cây cũng rất khác nhau. Tỷ lệ sống sót và khả năng sinh trưởng tốt nhất của các cây con đạt được ở giá thể gồm 50% Dớn và 50% xơ dừa (CT2). Ở giá thể này, cây thích ứng rất nhanh, chỉ sau 7 -10 ngày trồng cây đã có biểu hiện sinh trưởng rõ rệt. Cây to, mập, lá có màu xanh đậm và cho tỷ lệ sống cao nhất đạt 66,32% và thấp nhất ở giá thể bột dừa đạt 33,76%.

Tuy Dớn và xơ dừa là giá thể phù hợp nhất cho loài lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume nhưng tỷ lệ sống thu được không cao do đó chúng tôi tiếp tục tiến hành các thí nghiệm nhằm nâng cao tỷ lệ sống cho giống lan in vitro này.

3.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian huấn luyện cây trong bình đến tỷ lệ sống của lan Kim tuyến khi trồng lên giá thể

Mục đích của giai đoạn huấn luyện là tạo điều kiện cho cây trong môi trường in vitro dần làm quen với môi trường tự nhiên bên ngoài. Sau khi được huấn luyện, cây con sẽ cứng cáp, khoẻ mạnh hơn và đạt tỷ lệ sống cao khi đưa ra trồng ngoài nhà lưới, vườn ươm… Có thể coi giai đoạn này như giai đoạn thuần hoá cây trước khi tách khỏi điều kiện in vitro.

Trong điều kiện in vitro, cây con được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng, ánh sáng nhân tạo và vô trùng, tức là đã quen sống dị dưỡng. Khi đưa cây con ra trồng trên giá thể ở ngoài tự nhiên, cây con phải sống tự dưỡng, xung quanh là môi trường không vô trùng, ánh sáng tự nhiên. Do vậy, huấn luyên cây in vitro cũng giúp cây chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang trạng thái bán tự dưỡng, để khi đưa cây ra trồng ngoài vườn ươm cây có thể tự dưỡng ngay mà không ảnh hưởng đến sự sinh trưởng. Thời gian huấn luyện khác nhau giúp cây có khả năng thích nghi với điều kiện môi trường bên ngoài bình khác nhau, do đó có ảnh hưởng đến tỷ lệ sống cảu cây con khi đưa ra trồng ngoài vườn ươm.

3.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ huấn luyện cây ở nhà lưới đến tỷ lệ sống của lan Kim tuyến khi trồng lên giá thể

Bảng 3.11. Ảnh hưởng của chế độ huấn luyện cây ở nhà lưới đến tỷ lệ sống của lan Kim tuyến khi trồng lên giá thể

Công thức CT2 và CT3 có tỷ lệ cây sống cao nhất (99%) và thấp nhất là công thức ĐC (80,33%). Sức sống của cây con ở các thời gian che bóng khác nhau cũng khác nhau khá rõ. Công thức CT2 cây phát triển tốt nhất, cây mập, lá dày và xanh non, rễ phát triển và bám giá thể tốt. Công thức CT5 rễ bám giá thể khá tốt nhưng cây mảnh và lá mỏng mang màu xanh nhạt hơn ở công thức CT2.

Công thức ĐC cho tỷ lệ cây sống thấp nhất. Tuy cây phát triển khá tốt nhưng độ bám của rễ vào giá thể rất kém nên không đạt tiêu chuẩn.

Những ngày đầu đưa cây ra trồng ở nhà lưới/vườn ươm, luống cây được phủ kín nilon để giúp cây con tránh bị mất nước do bay hơi. Nếu luống cây không được che kín bằng nilon, cây con sẽ bị mất nước khi trời nắng hoặc gió lùa khiến cho cây bị héo và chết. Tuy nhiên, thời gian che kín luống cây bằng nilon kéo dài sẽ khiến cây bị quá thiếu ánh sáng dẫn đến bị “ớm”, cây cao nhưng mảnh và lá xanh nhạt làm khả năng quang hợp kém, hay ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của cây con.

Như vậy, khi đưa lan Kim tuyến ra trồng ở vườn ươm thì nên che bóng trong vòng 10 ngày là thích hợp.

IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4.1. Kết luận

Dựa vào kết quả thu được từ các thí nghiệm chúng tôi rút ra các kết luận sau:

1. Phương pháp khử trùng tạo mẫu sạch in vitro và cơ quan vào mẫu thích hợp:

Rửa sạch bằng xà phòng rồi đem ngâm trong cồn 70o trong 10s sau đó ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút.

Cơ quan vào mẫu thích hợp nhất là mắt đốt ngang thân, cho tỷ lệ sống cao đạt khoảng 72%, tỷ lệ tạo chồi là 100% và hệ số nhân đạt 4,56 lần

2. Môi trường khởi động và nhân nhanh thích hợp:

– Môi trường nền thích hợp để nhân nhanh Lan kim tuyến (A. setaceus) là môi trường Knud* + 20g/l sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar

– Môi trường: Knud* + 1,0 mg/l BAP hoặc 1,0 mg/l Kinetin + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar.

– Môi trường nhân nhanh phù hợp nhất: Knud* + 0,5mg/l BAP + 0,3 Kinetin + 0,3mg/l αNAA + 20g/l sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar.

3. Xác định môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh:

– Môi trường phù hợp nhất cho sự ra rễ ở loài Lan kim tuyến là Knud*/2 + 5% than hoạt tính.

4. Xác định điều kiện ra cây thích hợp với loài Lan Kim tuyến

– Giá thể phù hợp nhất với loài Lan Kim tuyến là: 50% Dớn + 50% xơ dừa.

– Thời gian huấn luyện cây trong bình phù hợp nhất là 8 ngày – Thời gian che luống cây phù hợp nhất là 10 ngày cho tỷ lệ cây sống là 99%

4.2. Đề nghị

Do thời gian quá ngắn nên cây lan Kim tuyến vẫn chưa được đưa vào sản xuất trên quy mô công nghiệp nên chúng tôi đề nghị tiếp tục nhân và sản xuất ra với số lượng lớn nhằm bảo vệ nguồn dược liệu quý và đáp ứng nhu cầu sử dụng lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) hiện nay.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Nguyễn Tiến Bân (chủ biên), Danh lục các loài thực vật Việt Nam, Tập 3, Nxb. Nông nghiệp, Hà Nội, 2005.

2. Bộ Khoa học và Công nghệ, Sách Đỏ Việt Nam (phần thực vật), Nxb. Khoa học Tự nhiên & Công nghệ, Hà Nội, 2007.

3. Chính Phủ Nước Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam, Nghị định số 32/2006/NĐ-CP, 2006.

4. Lê Thị Kim Đào, “Nghiên cứu thử nghiệm nhân một số giống cây trồng rừng bằng phương pháp nuôi cấy mô (Bạch đàn, cây Hông, Giổi xanh, Trầm hương)”, Tạp chí sinh học, 23, 3, tr.46-50, 2001.

5. Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam, Quyển 3, Nxb. Trẻ, Tp. Hồ Chí Minh, 2000.

6. Dương Công Kiên, Nuôi cấy mô thực vật, Nxb. Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh, 2002.

7. Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống Lan Ngọc Điểm Tai Trâu (Rhynchostylis gigantea) bằng phương pháp nuôi cấy trong ống nghiệm, Báo cáo khoa học Trường Đại học Lâm nghiệp, 2007.

8. Phùng Văn Phê và nnk, Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống In vitro loài Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume), Báo cáo khoa học Trường Đại học Lâm nghiệp, 2009.

9. Phùng Văn Phê, Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nguyễn Trung Thành, Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi In vitro loài Lan Kim tuyến (Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl)”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, 26(4), 248-253, 2010.

10. Phùng Văn Phê, Nguyễn Trung Thành, Vương Duy Hưng. “Đặc điểm hình thái, phân bố của loài Lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume ở Vườn Quốc gia Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, 26(2), 104-109, 2010.

11. Nguyễn Thị Quỳnh (2005), “Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên sự tăng trưởng của một số cây thân gỗ nhiệt đới và cận nhiệt đới trong điều kiện nuôi cấy in vitro”, Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN, tr. 42-44, 2005.

12. Nguyễn Đức Thành, Nuôi cấy mô, tế bào thực vật, Nghiên cứu ứng dụng, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, 2000.

13. Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn, Sinh lý học thực vật, Nxb. Giáo dục, Hà Nội, 2007.

Tài liệu từ Internet:

53. Kim Sinh (2011). “Đua nhau vào rừng sâu “săn”…cỏ !”, http://baoxuan.giadinh.net.vn/30635p0c1000/dua-nhau-vao-rung-sau-san-co.htm.

54. http://congnghexanhviet.com/San-pham/Giong-cay-trong/28/GIONG-CAYCHAT-LUONG-CAO.html

55. http://caythuocviet.com.vn/cay-thuoc-vi-thuoc/Lan-kim-tuyen.html

Tác giả

Phí Thị Cẩm Miện. LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC. NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH IN VITRO LOÀI LAN KIM TUYẾN (ANOECTOCHILUS SETACEUS BLUME) NHẰM BẢO TỒN NGUỒN DƯỢC LIỆU QUÝ


【#8】Lan Kim Tuyến Có Tác Dụng Gì? Giá Bao Nhiêu? Mua Ở Đâu Tốt Nhất?

Lan kim tuyến là một vị thảo dược quý hiếm nơi núi rừng Tây Bắc có chứa hoạt chất cao nên chúng được sử dụng điều trị nhiều căn bệnh như mất ngủ, bị tiểu đường, hỗ trợ điều trị gan, bệnh ung thư,…

1. Lan kim tuyến là gì?

Lan kim tuyến hay còn được biết với nhiều tên gọi khác nhau như cỏ nhung, lan gấm, giải thủy tơ, nam trùng thảo, cây kim cương,… Tên khoa học của lan kim tuyến là Anoectochilus setaceus Blume, thuộc họ nhà Lan.

Lan kim tuyến là một vị thuốc quý, chúng ưa những khu đất có nhiều mùn, xốp, độ ẩm cao và thoáng khí. Cây thường chỉ cao đến khoảng 20cm, thân mọng nước và có màu tím rất đẹp. Phần ngọn non của cây thì chứa nhiều lông mềm.

Hình ảnh 1: Cây lan kim tuyến

Lá lan kim tuyến thường có dạng hình trứng hoặc có dạng hình trái xoan, nhọn ở đầu và tròn dần về phần cuống. Mặt trên của lá thường có màu nâu sậm, ở giữa có các vệt vàng và hệ thống mạng gân màu hồng nhạt. Mặt dưới của lá thì có màu nhạt hơn so với mặt trên. Cuống lá phát triển thành bẹ, ôm chặt lấy thân cây.

Hoa lan kim tuyến có hình dáng giống như hoa lan, thường mọc thành các cụm. Chúng thường có màu đỏ hồng hoặc màu trắng rất đẹp. Hoa thường nở vào khoảng tháng 10 – tháng 12 và từ tháng 12 – tháng 3 năm sau là thời điểm cây đỗ quả.

1.1. Khu vực phân bố

Lan kim tuyến là một vị thuốc rất quý của núi rừng Tây Bắc. Chúng thường mọc ở các khu vực thuộc địa bàn Tây Bắc như Lào Cai, Hòa Bình, Yên Bái, Tuyên Quang, Lai Châu,… Là một dược liệu quý lại sinh trưởng với mật độ thấp nên giá bán lan kim tuyến rất cao và rất hiếm người đi rừng có thể bắt gặp vị thuốc này.

1.2. Bộ phận sử dụng làm thuốc và các thu hái

Toàn bộ các bộ phận của cây đều được sử dụng làm thuốc. Lan kim tuyến sẽ được thu hái quanh năm. Vì là vị thuốc quý nên khi thu hái, người ta chỉ cắt lấy phần thân ở trên mặt đất, không đào phần rễ để cho cây phát triển và cho ra nhiều vụ thu hoạch.

Sau khi thu hoạch, cây sẽ được phơi khô rồi bảo quản cẩn thận để sử dụng dần.

Hình ảnh 2: Tất cả các bộ phận của cây đều dùng làm thuốc

1.3. Thành phần hóa học

Trong lan kim tuyến có chứa rất nhiều hoạt chất quý, mang lại nhiều tác dụng cho y học như palmitic acid, beta – sitosterol, succinic acid, beta – D – glucopyranosy, stearic acid,… và rất nhiều các acid amin khác.

1.4. Tính vị và quy kinh

Lan kim tuyến có tính mát, vị ngọt nhưng hơi chát. Quy vào các kinh như Can – Thận, Phế, Tỳ.

2. Lan kim tuyến có tác dụng gì?

Với những hoạt chất quý, lan kim tuyến được sử dụng với tác dụng sau:

2.1. Lan kim tuyến chữa bệnh tiểu đường

Lan kim tuyến có tác dụng rất hiệu quả trong việc ổn định lượng đường huyết. Vì vậy mà chúng được khuyến khích sử dụng ở bệnh nhân bị tiểu đường.

2.2. Điều trị các bệnh về gan

Theo các chuyên gia, sử dụng lan kim tuyến rất tốt cho gan. Chúng có tác dụng giúp thanh lọc gan, giải nhiệt, giải trù uất và hạn chế tình trạng nóng gan. Đồng thời, các hoạt chất có trong vị thảo dược này còn có tác dụng giúp bảo vệ chức năng gan và tăng cường quá trình tái tạo các tế bào gan khỏi những tổn thương.

2.3. Lan kim tuyến chữa ung thư

Một trong những công dụng tuyệt vời nhất của lan kim tuyến chính là chữa bệnh ung thư. Theo các chuyên gia, hàm lượng các hoạt chất có trong lan kim tuyến, nhất là các acid amin có tác dụng rất hiệu quả trong việc điều trị một số căn bệnh ung thư ung thư phổi, ung thư gan,…

Hình ảnh 3: Lan kim tuyến chữa bệnh ung thư

2.4. Giúp bồi bổ cơ thể, cải thiện chứng mất ngủ, lo âu, căng thẳng

Ngoài những công dụng trên, lan kim tuyến còn có tác dụng giúp bổ khí huyết, hạn chế căng thẳng, stress, giúp lưu thông máu và tăng cường sức khỏe. Hơn nữa, việc sử dụng lan kim tuyến sẽ giúp bạn có một tinh thần thoải mái, lưu thông khí huyết và cải thiện tình trạng mất ngủ hiệu quả.

3. Đối tượng nào nên sử dụng lan kim tuyến?

  • Bệnh nhân bị tiểu đường, ung thư, cao huyết áp.
  • Bệnh nhân gặp các vấn đề về gan như xơ gan, ung thư gan,…
  • Người bệnh cơ thể suy nhược, thường xuyên mất ngủ,…

4. Các bài thuốc chữa bệnh về lan kim tuyến

4.1. Bài thuốc số 1: Điều trị bệnh ung thư

Cây xạ đen và lan kim tuyến được biết đến là hai vị thảo dược hàng đầu trong điều trị bệnh ung thư. Chuẩn bị 25g cây lan kim tuyến tươi kết hợp với 35g cây xạ đen đun nước uống hàng ngày.

4.2. Bài thuốc số 2: Điều trị các bệnh về gan

Chuẩn bị 25g cây lan kim tuyến kết hợp với 35g cà gai leo đem đun nước uống hàng ngày.

4.3. Bài thuốc số 3: Điều trị bệnh tiểu đường

Chuẩn bị 25g cây lan kim tuyến tươi đem đun với nước lọc. Sử dụng thuốc sau bữa ăn khoảng 15 phút.

4.4. Bài thuốc số 4: Điều trị chứng mất ngủ

Chuẩn bị 25g lan kim tuyến, 8g tâm sen, 10g hoa thiên lý, 8g cam thảo đất, 12g hoa nhài, 20g quyết minh tử, 10g huyền sâm, 15g hoài sơn và 8g ngưu tất đem sắc thuốc uống, mỗi ngày dùng hết 1 thang. Lưu ý nên chia thuốc làm 3 lần dùng trong ngày, dùng liên tục trong 1 tuần sẽ thấy được hiệu quả của bài thuốc.

Hình ảnh 4: Bài thuốc trị mất ngủ từ lan kim tuyến

4.5. Bài thuốc số 5: Bài thuốc giúp bồi bổ cơ thể, cải thiện chứng kém ăn

Chuẩn bị 25g lan kim tuyến, 15g mạch môn khô và 15g hoài sơn khô đem sắc thuốc uống hàng ngày.

5. Lan kim tuyến ngâm rượu

5.1. Lan kim tuyến ngâm rượu có tác dụng gì?

Rượu lam kim tuyến có tác dụng giúp:

  • Tăng cường sức khỏe, bồi bổ cơ thể
  • Tăng cường hệ tiêu hóa, hệ miễn dịch cho cơ thể,…

5.2. Cách ngâm rượu lan kim tuyến

  • Nguyên liệu: 1kg lan kim tuyến tươi hoặc 500g lan kim tuyến khô, 3 lít rượu trắng trên 40 độ và bình thủy tinh để ngâm rượu.
  • Lan kim tuyến đem rửa sạch, để ráo nước rồi cho vào bình, đổ rượu vào ngâm rồi đậy kín nắp.
  • Sau khoảng 1 tháng là có thể sử dụng được.

Rượu lan kim tuyến mặt dù rất tốt cho sức khỏe nhưng không nên quá lạm dụng, mỗi ngày hãy sử dụng một hàm lượng thích hợp để phát huy tối đa hiệu quả của thuốc.

Hình ảnh 5: Cách ngâm rượu lan kim tuyến

6. Lan kim tuyến giá bao nhiêu?

Lan kim tuyến bao nhiêu tiền 1kg? Hiện nay, trên thị trường, giá lan kim tuyến tương đối cao bỏi vì đây là một vị thuốc rất quý hiếm:

  • Đối với loại tươi: 4.000.000 VNĐ/kg.
  • Đối với loại khô: 12.000.0000 VNĐ/kg.

7. Lan kim tuyến mua ở đâu?

Là một vị thuốc quý, giá thành lại tương đối cao nên khi mua lan kim tuyến, bạn nên lựa chọn những địa chỉ uy tín để mua hàng, tránh trường hợp mua phải hàng giả, hàng kém chất lượng. Nếu có thể hãy tham khảo ý kiến của những người thân quen và tìm đến những website, địa chỉ uy tín để mua hàng chất lượng. Nên mua lan kim tuyến ở đâu?

Cây Thuốc Dân Gian là một địa chỉ bán lan kim tuyến chất lượng với mức giá ưu đãi. Bên cạnh lan kim tuyến, của hàng chúng tôi còn cung cấp rất nhiều vị thảo dược quý khác nữa. Khi sử dụng các sản phẩm bên cửa hàng, bạn hoàn toàn yêu tâm bởi tất cả các sản phẩm đều được chúng tôi kiểm tra chất lượng, nguồn gốc kỹ càng trước khi đưa đến tay người tiêu dùng.

Hình ảnh 6: Cây Thuốc Dân Gian – Địa chỉ bán lan kim tuyến uy tín

Với phương châm “Cây thuốc của mọi nhà”, chúng tôi luôn cố gắng để mang lại những sản phẩm chất lượng nhất, an toàn cho sức khỏe người dùng. Cam kết nói KHÔNG với hàng kém chất lượng, hàng Trung Quốc trôi nổi trên thị trường.

Khách hàng đặt mua có thể liên hệ đến chúng tôi theo các thông tin sau:

  • Số điện thoại: 0869145860
  • Địa chỉ: thôn Đa Sỹ, xã Cao Thắng, huyện Lương Sơn, tỉnh Hoà Bình

Chính sách bán hàng:

  • Giao hàng tận nhà thông qua đường bưu điện.
  • Cam kết hoàn tiền nếu khách hàng phát hiện hàng kém chất lượng, bị hư hỏng.


【#9】Hoàn Thiện Quy Trình Nhân Giống Lan Kim Tuyến (Anoectochilus Setaceus Blume)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH – KTNN

===o0o===

PHẠM THỊ NHUNG

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH

NHÂN GIỐNG LAN KIM TUYẾN

(ANOECTOCHILUS SETACEUS BLUME)

BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ

BÀO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

HÀ NỘI, 2021

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH – KTNN

===o0o===

PHẠM THỊ NHUNG

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH

NHÂN GIỐNG LAN KIM TUYẾN

(ANOECTOCHILUS SETACEUS BLUME)

BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ

BÀO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

Người hướng dẫn khoa học:

TS. La Việt Hồng

HÀ NỘI, 2021

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến

TS. La Việt Hồng đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp

đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Tôi xin chân thành cảm ơn ban Lãnh đạo trường Đại học Sư phạm Hà

Nội 2, Ban chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN trường học Sư phạm Hà Nội 2, đã

tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành khóa luận này.

Trong thời gian thực hiện đề tài tôi cũng nhận được sự giúp đỡ tận

tình của cô Mai Thị Hồng – Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật đã giúp đỡ,

đóng góp ý kiến để tôi hoàn thành khóa luận này, nhân đây tôi cũng xin

chân thành cảm ơn.

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, tạo mọi

điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi học tập cũng như hoàn thành

khóa luận.

Mặc dù đã hết sức cố gắng nhưng do điều kiện thời gian và trình độ

chuyên môn còn nhiều hạn chế nên không tránh khỏi những thiếu sót, tôi

rất mong nhận được sự góp ý của quý thầy cô để khóa luận của tôi có thể

hoàn thiện hơn.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 12 tháng 04 năm 2021

Sinh viên

Phạm Thị Nhung

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan kết quả nghiên cứu đề tài: “Hoàn thiện quy trình

nhân giống lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) bằng kỹ

thuật nuôi cấy mô tế bào” là kết quả nghiên cứu của riêng tôi do TS. La Việt

Hồng hướng dẫn. Các số liệu, kết quả trong nghiên cứu này là trung thực và

chưa được ai công bố.

Hà Nội, ngày 12 tháng 04 năm 2021

Sinh viên

Phạm Thị Nhung

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

NAA:

Napthlacetic acid

BAP:

6-Benzyl amino purin

KI:

Kinetin

MS:

Murashige và Skoog

Nxb:

Nhà xuất bản

CT:

Công thức

ĐC:

Đối chứng

TDZ:

Thidiazuron

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ………………………………………………………………………………………….. 1

1. Lý do chọn đề tài …………………………………………………………………………. 1

2. Mục đích nghiên cứu ……………………………………………………………………. 3

3. Nội dung nghiên cứu ……………………………………………………………………. 3

4. Phạm vi nghiên cứu ……………………………………………………………………… 3

5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn ……………………………………………. 3

NỘI DUNG ……………………………………………………………………………………….. 4

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ……………………………………………………. 4

1.1. Giới thiệu về cây lan Kim tuyến………………………………………………….. 4

1.1.1. Phân loại ……………………………………………………………………………. 4

1.1.2. Đặc điểm thực vật học ………………………………………………………….. 4

1.1.3. Sinh học và sinh thái ……………………………………………………………. 5

1.1.4. Phân bố ………………………………………………………………………………. 5

1.1.5. Công dụng của lan Kim tuyến ……………………………………………….. 5

1.1.6. Thực trạng khai thác và phát triển cây lan Kim tuyến

ở Việt Nam …………………………………………………………………………………… 8

1.1.7. Các loài lan Kim tuyến có ở Việt Nam ……………………………………. 8

1.2. Tình hình nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn lan Kim tuyến …….. 10

1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ……………………………………….. 10

1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ………………………………………….. 12

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……………….. 15

2.1. Vật liệu thực vật ……………………………………………………………………… 15

2.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ………………………………………………….. 15

2.2.1. Dụng cụ ……………………………………………………………………………. 15

2.2.2. Thiết bị ……………………………………………………………………………… 15

2.3. Môi trường nuôi cấy ………………………………………………………………… 15

2.4. Điều kiện nuôi cấy in vitro ……………………………………………………….. 15

2.5. Phương pháp nghiên cứu ………………………………………………………….. 16

2.5.1. Bố trí thí nghiệm ………………………………………………………………… 16

2.5.3. Phương pháp phân tích thống kê kết quả thực nghiệm ……………. 18

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN …………………….. 19

3.1. Hoàn thiện giai đoạn tái sinh lan Kim tuyến in vitro ……………………. 19

3.2. Hoàn thiện giai đoạn ra rễ tạo cây lan Kim tuyến in vitro

hoàn chỉnh…………………………………………………………………………………….. 22

3.3. Hoàn thiện giai đoạn rèn luyện cây lan Kim tuyến với điều kiện

tự nhiên ………………………………………………………………………………………… 24

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ……………………………………………………………. 26

TÀI LIỆU THAM KHẢO ……………………………………………………………….. 27

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Ảnh hưởng của BAP và Kinetin đến khả năng tạo cụm chồi

cây lan Kim tuyến ………………………………………………………………17

Bảng 2.2: Ảnh hưởng của α – NAA đến tạo rễ của cây lan Kim tuyến

in vitro………………………………………………………………………………17

Bảng 2.3: Ảnh hưởng của giá thể tới tỉ lệ sống của lan Kim tuyến

in vitro………………………………………………………………………………18

Bảng 3.1. Kết quả tái sinh chồi lan Kim tuyến (số chồi/mẫu) ………………..19

Bảng 3.2. Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh in vitro lan Kim tuyến

Bảng 3.3. Rèn luyện cây in vitro ngoài tự nhiên

………………..23

………………………………24

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume ………………………. 4

Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu ………………………………………………………………… 16

Hình 3.1. Cụm chồi lan Kim tuyến ……………………………………………………… 21

Hình 3.2. Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh in vitro từ chồi lan Kim tuyến…………… 23

Hình 3.3. Rèn luyện cây lan Kim tuyến ngoài môi trường tự nhiên ở các

giá thể khác nhau ………………………………………………………………… 25

MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài

Lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) thuộc họ Phong lan

(Orchidaceae) là loại thảo dược quý hiếm của Việt Nam và nhóm thực vật rừng đang nguy cấp EN A1a, c, d, trong

sách đỏ Việt Nam .

Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng khắc phục được nhiều trở

ngại mà những phương pháp nhân giống khác thường gặp, sau đây là những

ưu điểm chính: cây con được trẻ hóa và sạch bệnh, vì vậy có tiềm năng sinh

trưởng, phát triển và đạt năng suất cao. Tạo cây con đồng nhất về mặt di

truyền, bảo tồn được các tính trạng đã chọn lọc. Tạo được dòng thuần của

các cây tạp giao. Tạo được cây có gen mới (đa bội, đơn bội). Bảo quản và

lưu trữ tập đoàn gen. Có khả năng sản xuất quanh năm. Có thể nhân nhanh

nhiều cây không kết hạt trong những điều kiện sinh thái nhất định hoặc hạt

nảy mầm kém. Hệ số nhân giống cực cao, rút ngắn thời gian đưa một giống

mới vào sản xuất đại trà .

Quá trình nhân giống cây trồng trong môi trường in vitro gồm nhiều

giai đoạn khác nhau gồm: (i) tạo vật liệu khởi đầu; (ii) nhân nhanh chồi; (iii)

ra rễ cho chồi in vitro và (iv) chuyển cây ra rèn luyện với điều kiện tự nhiên.

Mỗi giai đoạn có những yêu cầu riêng. Trong đó giai đoạn quan trọng nhất

quyết định sự thành công của quy trình nuôi cấy là giai đoạn nhân nhanh

chồi và giai đoạn rèn luyện cây con thích nghi với môi trường tự nhiên . Năm 2014, tác giả Trần Thị Hồng Thúy và cộng sự đã tìm ra

môi trường Knudson C lỏng chứa 1% saccarozơ, 100 ml.L-1 nước dừa và

0,5 mg.L-1 Kinetin, tỉ lệ hình thành PLBs đạt 86,25%, PLBs sinh trưởng tốt

… Tuy nhiên, việc

nghiên cứu này mới chỉ dừng lại ở một số giai đoạn mà chưa hoàn thiện

được quy trình nhân giống cây lan này. Do vậy, tôi quyết định nghiên cứu

đề tài: “Hoàn thiện quy trình nhân giống lan Kim tuyến (Anoectochilus

setaceus Blume) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào” nhằm cải thiện một

số giai đoạn của quy trình nhân giống in vitro loài lan này với mục đích bảo

tồn và phát triển được nguồn giống lan Kim tuyến, cung cấp cây giống có

chất lượng cho thị trường.

Phạm Thị Nhung

2

2. Mục đích nghiên cứu

Hoàn thiện quy trình nhân nhanh loài lan Kim tuyến (Anoectochilus

setaceus Blume) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào, nhằm góp phần bảo

tồn và phát triển loài lan dược liệu quý hiếm của Việt Nam, đáp ứng nhu cầu

cây lan Kim tuyến giống phục vụ nhu cầu con người.

3. Nội dung nghiên cứu

Hoàn thiện giai đoạn nhân nhanh giống cây lan Kim tuyến bằng kỹ

thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật.

Hoàn thiện giai đoạn ra rễ của lan Kim tuyến in vitro.

Hoàn thiện giai đoạn rèn luyện cây con lan Kim tuyến in vitro.

4. Phạm vi nghiên cứu

Phòng thí nghiệm Sinh lí thực vật, khoa Sinh – KTNN, trường Đại học

Sư phạm Hà Nội 2.

5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

5.1. Ý nghĩa khoa học

Góp phần bổ sung vào nguồn tài liệu nghiên cứu về nhân giống in vitro

cây lan Kim tuyến.

5.2. Ý nghĩa thực tiễn

Tạo ra được nguồn cây giống với số lượng lớn và sạch bệnh cung cấp

cho thị trường.

Góp phần bảo tồn được nguồn gen của loài lan Kim tuyến.

Phạm Thị Nhung

3

NỘI DUNG

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu về cây lan Kim tuyến

1.1.1. Phân loại

Giới: Plantea (Thực vật)

Bộ: Asparagales

Họ: Orchidaceae

Phân họ: Orchidoideae

Chi: Anoectochilus

Loài: A. setaceus

Tên khoa học: Anoectochilus

setaceus Blume

Tên Việt Nam: Lan Kim tuyến

Hình 1.1. Lan Kim tuyến

Anoectochilus setaceus Blume

Tên gọi khác: Lan Gấm

.

Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, chóp hơi nhọn và có mũi ngắn, cỡ 3 – 4

x 2 – 3 cm, có màu khác nhau với mạng gân thường nhạt hơn (màu lục sẫm

Phạm Thị Nhung

4

với mạng gân màu lục nhạt hay màu nâu – đỏ với mạng gân màu vàng – lục

hay hồng); cuống lá dài 2 – 3 cm .

1.1.3. Sinh học và sinh thái

Mùa hoa tháng 2 – 4. Tái sinh bằng chồi từ thân rễ và hạt, ít và sinh

trưởng rất chậm. Mọc dưới tán rừng nguyên sinh, hầu hết là nguyên thủy,

rậm thường xanh nhiệt đới mưa mùa cây lá rộng trên sườn núi đá granit,

riôlit, phiến sét, ở độ cao 500 – 1600 m, rải rác thành từng nhóm vài ba cây

trên đất ẩm, rất giàu mùn và lá cây rụng .

Thế giới: Ấn Độ, Nêpan, Butan, Trung Quốc, Mianma, Thái Lan, Lào,

Campuchia, Malaixia, Inđônêxia .

Ông Tả Mộc Thuấn – học giả người Nhật (năm 1924), nghiên cứu về

Trung y đã cho biết: Kim tuyến liên là một trong những cây thuốc quý trong

dân gian; toàn thân cây thuốc được dùng để làm tăng cường sức khỏe, chủ

trị bệnh phổi, di tinh, xuất tinh sớm, yếu gan, yếu tỳ và các vết thương do

rắn cắn; còn có tác dụng bổ máu, giải nhiệt .

Trong sách Thanh thảo gia đình tự liệu pháp của ông Trần Đào Thích

có viết: Trẻ em hay khóc dùng Kim tuyến liên sắc uống sẽ khỏi .

Trong báo cáo điều tra năm 1964, ông Cam Vĩ Tùng đã cho biết: Kim

tuyến liên là một vị thuốc hết sức quý giá trong các tiệm thuốc bắc Đài

Loan, là cây thuốc mang tính mát và có vị ngọt, thanh nhiệt, thanh huyết, bổ

phổi, giải trừ u uất, thông trung khí, bồi dưỡng sức khỏe, chủ trị lục phủ ngũ

tạng đẩy lùi tâm hỏa, nóng gan, bệnh phổi, thổ huyết, ho hen, đau ngực, đau

lá lách, đau cuống họng, cao huyết áp, trẻ con chậm lớn, suy thận .

Phạm Thị Nhung

6

Trong y học hiện đại bằng nhiều công trình nghiên cứu khoa học, các

nhà khoa học ở nhiều Viện và Trường đại học Y trên thế giới đã cung cấp

các bằng chứng cho thấy nhiều công dụng của lan Gấm – lan Kim tuyến như

.

Đặc biệt, cách đây vài năm, rộ lên cơn sốt lan Gấm khi các đầu mối

Hàn Quốc, Đài Loan, Trung Quốc mua lại với giá khoảng 3,5 – 4 triệu đồng

/1 kg tươi. Vì vậy, rất nhiều người dân đã lặn lội trong rừng sâu, lùng hái lá

lan Gấm để bán cho các đầu mối thu mua với giá khoảng 500 ngàn đồng

1/kg lá tươi, dần dần khi khan hiếm, cạn kiệt, giá của lan Gấm được đẩy lên

1,2 – 1,6 triệu đồng/1 kg lá tươi .

Phải chăng, đã đến lúc chúng ta phải có những đánh giá nghiêm túc,

công trình nghiên cứu chính thức về giá trị tài nguyên của dược liệu quý,

chẳng hạn như cây lan Gấm… Để từ đó, có được những hướng phát triển

cũng như khai thác các loại dược liệu quý, thay vì để các doanh nghiệp nước

ngoài lợi dụng sự thiếu hiểu biết của ta để trục lợi.

1.1.7. Các loài lan Kim tuyến có ở Việt Nam

Theo GS. Phạm Hoàng Hộ (Cây cỏ Việt Nam, tập III), ở Việt Nam chi

lan Kim tuyến gồm có những loài sau .

Với công trình nghiên cứu gieo hạt in vitro cây A. roxburghii, tác giả

Huang H và cộng sự (2002) đã tìm ra được môi trường Knudson C có bổ

sung 0,5 mg/L BAP + 20% dịch khoai tây là thích hợp nhất cho sự phát triển

protocom từ hạt của A. roxburghii .

Y.J. Shiau và cộng sự (2005) nghiên cứu nhân giống loài lan Kim

tuyến (Haemaria discolor (Ker) Lindl. var.) bằng phương pháp gieo hạt in

vitro. Các hạt sau khi nảy mầm cấy chuyển trên môi trường ½ MS bổ sung

0,2% than hoạt tính, 8% dịch chuối, 0,1 mg dm-3 (TDZ) và 1,0 mg dm-3

(NAA) cho cây sinh trưởng và phát triển tốt. Có tới 96% cây sống sau khi

chuyển ra nhà kính .

Nghiên cứu kĩ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng nhằm mục tiêu bảo tồn

và phát triển cây A. elatus Lindley, tác giả N. Ahamed Sherif và cộng sự

(2012) đã sử dụng chồi đỉnh và chồi bên làm vật liệu nuôi cấy. Trên môi

Phạm Thị Nhung

11

trường MS có bổ sung 3,0 mg/l TDZ và 3,5 mg/l KI thích hợp nhất cho nhân

nhanh cụm chồi. Tỷ lệ ra rễ đạt cao nhất khi bổ sung vào môi trường 0,3 g/l

than hoạt tính .

Phùng Văn Phê và cộng sự (2010) đã nghiên cứu đặc điểm hình thái,

phân bố của loài lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume ở vườn quốc

gia Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc .

Nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin và sự kết hợp giữa Kinetin và 2,4 D đến quá trình hình thành protocom-like bodies ở cây lan Kim tuyến

(Anoectochilus setaceus Blume), tác giả Trần Thị Hồng Thúy và cộng sự

(2014). Trong nghiên cứu này, chồi của cây lan Kim tuyến được sử dụng

làm nguyên liệu ban đầu để cảm ứng hình thành PLBs trong môi trường

Knudson C lỏng chứa 100 ml.L-1 nước dừa và bổ sung Kinetin hoặc sự kết

hợp giữa Kinetin với 2,4-D. Kết quả cho thấy PLBs được hình thành tốt nhất

trên môi trường Knudson C lỏng chứa 1% saccarozơ, 100 ml.L-1 nước dừa

và 0,5 mg.L-1 Kinetin, tỉ lệ hình thành PLBs đạt 86,25%, PLBs sinh trưởng

tốt. Trong khi đó, sự kết hợp giữa 2,4-D ở nồng độ 0,5 mg.L-1 với một số

nồng độ của Kinetin (0,5; 1,0; 1,5 mg.L-1) không có tác dụng lớn trong việc

cảm ứng hình thành PLBs ở cây lan Kim tuyến .

Từ các kết quả trên cho thấy ở Việt Nam cũng đã có nhiều nghiên cứu

về việc nhân giống và bảo tồn lan Kim tuyến. Tuy nhiên, việc nghiên cứu

này mới chỉ dừng lại ở một số đối tượng và chưa hoàn thiện được kỹ thuật

trồng, chăm sóc đầy đủ. Các kết quả nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở mức độ

nghiên cứu trong phòng thí nghiệm, chưa được áp dụng vào sản xuất.

Phạm Thị Nhung

14

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu thực vật

Cây lan Kim tuyến in vitro do Phòng Sinh lý thực vật, Khoa Sinh KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 cung cấp.

2.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm

2.2.1. Dụng cụ

Dao cấy, khay cấy, kéo, túi nilon, bình tam giác, đèn cồn, bình xịt cồn

vỉ xốp nuôi cấy,…

2.2.2. Thiết bị

Các thiết bị sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật: cân kĩ thuật, máy đo

pH, nồi hấp khử trùng, máy cất nước hai lần, buồng cấy vô trùng, máy

khuấy từ ra nhiệt,…

2.3. Môi trường nuôi cấy

Các thí nghiệm nuôi cấy in vitro đều sử dụng môi trường dinh dưỡng

cơ bản (Murashige và Skoog, 1962) [20]: MS + 30 g/l đường saccarozơ + 7

g/l agar và các chất điều hòa sinh trưởng.

pH môi trường: 5,8

Môi trường được khử trùng trong nồi hấp khử trùng ở nhiệt độ 117oC

trong 15 phút.

2.4. Điều kiện nuôi cấy in vitro

Các thí nghiệm đều được thực hiện trong điều kiện nhân tạo.

Thời gian chiếu sáng: 16 giờ sáng/8 giờ tối.

Nhiệt độ: 25 ± 2o C.

Độ ẩm: 70 – 80%

Cường độ ánh sáng: 2000 lux.

Phạm Thị Nhung

15

2.5. Phương pháp nghiên cứu

2.5.1. Bố trí thí nghiệm

Nghiên cứu được tiến hành gồm 3 thí nghiệm, các thí nghiệm được bố

trí theo sơ đồ hình 2.1.

Cây lan Kim tuyến in vitro

+ BAP

+ Kinetin

Nhân nhanh lan Kim tuyến

+ NAA

Tạo cây lan Kim tuyến in vitro hoàn chỉnh

+ Xơ dừa, đất, phân bò

Rèn luyện cây in vitro ngoài môi trường tự nhiên

Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu

Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần

nhắc lại.

2.5.2. Phương pháp nghiên cứu

2.5.2.1. Thí nghiệm 1: Hoàn thiện giai đoạn nhân nhanh lan Kim tuyến bằng

kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

Thí nghiệm tiến hành trên môi trường cơ bản: MS + 30 g/l đường, 7 g/l

agar có bổ sung KI và BAP với nồng độ như sau:

Phạm Thị Nhung

16


【#10】Nhộn Nhịp ‘chợ’ Lan Rừng Lớn Nhất Huế

Ở Huế, giới chơi phong lan vẫn rỉ tai nhau về một phiên chợ bán lan rừng. Ở đó, những tay chơi lan khó tính nhất cũng phải hài lòng về sự phong phú của các loại lan.

Một người bạn của tôi rất yêu và đam mê chơi phong lan ở Huế cho biết, phiên chợ ấy chỉ diễn ra vào 2 ngày cuối tuần là thứ 7 và chủ nhật. Lần theo hướng dẫn của anh bạn này, chúng tôi có mặt tại công viên Thương Bạc (TP Huế). Không khó để nhận ra cảnh tượng tương đối nhộn nhịp được tạo ra bởi những chủ bán lan và người mua lan ở đây.

Nhộn nhịp ‘chợ’ lan rừng lớn nhất Huế

Trong khi những người bán lan đang nhiệt tình cầm tờ “ca-ta-lô” giới thiệu từng loại lan về tên gọi, nguồn gốc, cách chăm sóc, thế lan… thì những khách hàng lại tỉ mẩn xem xét, ngắm nghía từng nhánh, chùm lan rồi hỏi về giá, sắc hoa… Họ cùng nhau bàn luận về tương lai của những nhánh lan, nghe rất rôm rả.

Quang cảnh nhộn nhịp của phiên ‘chợ’ lan rừng ở một góc công viên Thương Bạc (TP Huế).

Một người bán lan ở đây nhiệt tình giới thiệu với tôi đủ loại lan rừng phong phú về chủng loại và đa dạng về màu sắc. Đó là nghinh xuân, tai trâu, đuôi chồn, đuôi cáo, quế tím, quế vàng, các loại lan hồ điệp, kim tuyến, kim điệp, vũ nữ, đoản kiếm, ô lôi… Tất cả chúng được những người chủ này khẳng định là phong lan hái từ rừng 100%.

Ở đây, có đủ loại lan rừng được bày bán phong phú về chủng loại, đa dạng về màu sắc. Người mua tha hồ lựa chọn các loại lan.

Tại khu chợ này, một số người bán lan mặc trang phục dân tộc thiểu số và nói tiếng Kinh còn chưa rõ. Một người bán lan cho biết, nhóm của họ là người dân tộc Vân Kiều ở trên Khe Sanh, Hướng Hóa (Quảng Trị). Những nhánh lan rừng họ bày bán ở đây được người thân của họ khai thác từ những cánh rừng tận biên giới giáp nước bạn Lào. Vào mỗi dịp cận Tết hoặc đầu năm, do thấy nhiều khách hàng thích mua lan về chưng và chăm sóc, họ bắt xe vào Huế bày bán lan ở góc công viên Thương Bạc này để kiếm thêm thu nhập.

Người bán thường là những người dân tộc thiểu số ở trên các vùng miền núi Thừa Thiên – Huế, Quảng Trị.

Giá cả của những loại lan ở đây được mua bán theo phương thức “thuận mua vừa bán”, nghĩa là không có một giá cố định. Bởi, có những nhánh lan trong mắt người này rất đỗi bình thường nhưng trong mắt người khác lại là cả một vẻ đẹp đầy mê hoặc. Cho nên, giá cả từ đó mà cũng được bán cao hay thấp.

Giỏ lan ô lôi gắn với thân cây và có hoa này được định giá 400 nghìn.

Trong khi đó, có một số loại lan được bán theo cân từ 150 nghìn – 300 nghìn/kg nhưng cũng có loại được bán theo nhánh, chùm, giá tùy vào độ quý hiếm và vẻ đẹp của hoa khi bung nở.

Địa lan được bán 100 nghìn/cây.

Khi đến đây, người chơi lan không cần mất nhiều thời gian cũng có thể chọn cho mình nhiều loại lan rừng ưng ý về sở thích, lẫn giá cả.

Ông Đặng Văn Vinh, trú ở phường Thuận Hòa (TP Huế), một người có nhiều kinh nghiệm chơi lan cho biết, những loại lan bày bán ở công viên Thương Bạc rất được người chơi lan ưa thích vì chúng có vẻ đẹp hoang dã đặc trưng của núi rừng tự nhiên. Tuy nhiên, càng sau này những nhánh lan quý hiếm được bày bán ở đấy càng ít dần đi, lâu lâu mới bắt gặp.

Vẻ đẹp của một khóm lan rừng được một tay chơi lan ở Huế chăm sóc sau khi mua ở phiên chợ này về.

“Hiện, nhiều người thấy hoa lan đẹp là mua về trồng chứ không có kiến thức chăm sóc gì hết, dẫn đến nhiều nhánh lan rừng bị chết rất uổng. Trong khi đó, bà con dân tộc thiểu số trên vùng cao thì đua nhau vào rừng hái lan. Nếu không cân bằng giữa thú chơi tao nhã này với cách khai thác lan rừng đúng cách thì mai đây vẻ đẹp của những nhánh phong lan sẽ không còn thấy ở các cánh rừng tự nhiên nữa đâu”, ông Vinh tỏ ra lo lắng.


Bạn đang xem chủ đề Can Mua Lan Kim Tuyen trên website Inkndrinkmarkers.com. Hy vọng những thông tin mà chúng tôi đã chia sẻ là hữu ích với bạn. Nếu nội dung hay, ý nghĩa bạn hãy chia sẻ với bạn bè của mình và luôn theo dõi, ủng hộ chúng tôi để cập nhật những thông tin mới nhất. Chúc bạn một ngày tốt lành!